A aplicação de ácido retinóico para obter culturas de osteócitos principal do mouse osteoblastos
Summary
Tratamento de osteoblastos primários de rato com ácido retinóico produz uma população homogênea de células ramificadas que carregam características morfológicas e moleculares de osteócitos. O método supera a dificuldade de obtenção e manutenção de osteócitos primárias em cultura, e pode ser vantajosa para o estudo de células derivadas de modelos transgénicos.
Abstract
A necessidade de culturas osteócitos é bem conhecido para a comunidade de pesquisadores de osso; isolamento de osteócitos primário é difícil e produz números de celular de baixa. Portanto, o sistema celular mais extensamente utilizado é a linha de células MLO-Y4-osteócito semelhantes.
O método aqui descrito refere-se à utilização de ácido retinóico para gerar uma população de células homogéneas ramificadas com características morfológicas e osteócitos moleculares.
Após o isolamento de osteoblastos de calvárias de ratinho, o ácido all-trans retinóico (ATRA) é adicionado ao meio celular, e monitorização celular é conduzida por dia, sob um microscópio invertido. Primeiros alterações morfológicas são detectáveis após 2 dias de tratamento e diferenciação está geralmente completa em 5 dias, com o desenvolvimento progressivo de dendrites, a perda da capacidade para produzir matriz extracelular, a infra-regulação de marcadores de osteoblastos e a sobre-regulação de moléculas específicas de osteócitos.
conteúdo "> monitoramento de células diária é necessária devido à variabilidade inerente de pilhas, eo protocolo pode ser adaptado com variação mínima de células obtidas a partir de diferentes linhagens de camundongos e aplicadas a modelos transgênicos.O método é fácil de realizar e não requerem instrumentação especial, que é altamente reprodutível, e rapidamente gera uma população osteócito madura em completa ausência de matriz extracelular, que permite a utilização destas células para aplicações biológicas ilimitadas.
Introduction
Osteócitos, o tipo de célula mais abundante do osso, são terminalmente diferenciados, células altamente ramificados profundamente situadas dentro do esqueleto. O corpo celular de osteócitos maduros estão contidas em lacunas de osso e têm diversas formas; osteócitos com corpos celulares alongados são encontrados no osso cortical, enquanto osteocytes arredondadas são mais freqüentes no osso trabecular 1. Dendritos ramificados estender a partir do corpo celular e residem em pequenos canais chamados canalículos, formando uma intrincada rede que faz com que vários contatos não só com outros osteócitos, mas também com outros tipos de células do osso, medula óssea, vasos sanguíneos e pericitos associados. Através do fluido intersticial contido nas lacunas e canalículos, osteócitos estão também em última análise, ligado ao sistema de circulação, pelo que pode influenciar não só local, mas também efeitos sistémicos, e vice-versa, o seu comportamento pode ser regulada por ambas as alterações locais e sistémicas 2.
Oestudo de osteócitos recentemente ganhou impulso, graças a uma série de avanços técnicos, tais como a geração de-tecidos e animais transgénicos específicos de células, a utilização de técnicas de microscopia potentes e de rastreio molecular de alto rendimento 3,4. No entanto, o conhecimento destas células ainda é incompleta, principalmente devido à escassez relativa de adequada em modelos in vitro. Na verdade, osteócitos sempre foram difíceis de obter e manter na cultura devido à localização profunda, e ao baixo nível de proliferação que caracteriza esse tipo de célula diferenciada.
Ao longo dos anos, um número de métodos tem sido desenvolvida para isolar osteócitos primário 5-7, embora eles geralmente produzem rendimentos celulares baixas e comporta o risco de que mesmo poucos fibroblastos contaminantes irá cobrir rapidamente osteócitos 8. Por esta razão, a maior parte do trabalho experimental in vitro tem sido realizada até agora para a célula osteócito bem estabelecida line MLO-Y4 9.
Metodologias in vitro adicionais podem aumentar a possibilidade de estudar essas células e pode melhorar a análise da biologia osteócito e fisiopatologia. Para ser amplamente adotada, tais métodos devem ser fáceis de reproduzir, e não exigiria instrumentos especiais ou tempos muito longos para alcançar a maturação celular. Mais importante, se for o caso de células primárias, elas tornam possível tirar proveito de animais transgénicos. Descrevemos recentemente que o tratamento de células da linha osteoblástica MC3T3-E1 e em osteoblastos primários com ácido retinóico induz uma mudança de fenótipo rápida que leva ao desenvolvimento de uma população de células homogéneas ramificadas rolamento características morfológicas e moleculares de osteócitos 10.
All-trans ácido retinóico (ATRA) é um produto metabólico ativa da vitamina A, que regula a transcrição de genes pelos receptores de ácido retinóico nucleares (RAR) vinculativo. RARse ligam ao DNA, como heterodímeros com os receptores de retinóide X (RXRs), em última análise conduzindo à modulação de ácido retinóico (RA)-responsivo genes alvo 11. ATRA foi mostrado para modular a diferenciação e maturação de vários tipos de células, entre as quais as outras células ramificadas, tais como as células neuronais e podócitos 12 13.
O método aqui descrito baseia-se na adição de ATRA para osteoblastos primários. Para ser eficaz, a ATRA tem de ser adicionado a uma fase de maturação precisas sobre células plaqueadas a uma densidade definida; em nossa experiência essas condições são fundamentais para obter a chave de fenótipo de osteoblastos para osteócitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nos últimos anos, o osteócito emergiu como a célula mais central do osso. Avanços da pesquisa são progressivamente revelando um número de propriedades osteócitos anteriormente insuspeitas ou não comprovadas, que são de enorme valor para a concepção de novos e melhores tratamentos para uma variedade de doenças ósseas. No entanto, a investigação de biologia osteócito tem vindo a sofrer de disponibilidade limitada de modelos in vitro de tal forma que os osteoblastos têm sido utilizados como substi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O financiamento foi fornecido por "Progetto um concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010" para MD, e Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano
Materials
| Name | Company | Cat # | comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37°C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37°C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| fluorsave | Calbiochem – Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight,10cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| microscope | Zeiss Apotome | ||
| spectrometer | Safas Xenius |
References
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte–a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. 45 (4), 682-692 (2009).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. J Bone Miner Res. 7 (4), 389-396 (1992).
- Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J. Osteocyte isolation and culture. Methods Mol Med. 80, 41-50 (2003).
- Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice. Biotechniques. 52 (6), 361-373 .
- Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte. Bone. 54 (2), 296-206 .
- Bonewald, L. F. Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).
- Mattinzoli, D., et al. A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment. Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
- Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation. J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).
- Vaughan, M. R., et al. ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo. Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).
- Dodig, M., et al. Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice. J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. A practical guide for biomedical research. , (2010).
- Woo, S. M., Rosse, r. J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Gu, G., Nars, M., Hentune, n. T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).
- Boukhechba, F., et al. Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system. J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).
- Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 .
- Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation. J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 .
- Hirao, M., et al. Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes. J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).
- Brounais, B., et al. Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria. Bone. 44 (5), 830-839 (2009).
- Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).
- Poole, K. E., et al. Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation. FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell and More. Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).
