Summary

Scalabile High Throughput Selection Da sintetici Biblioteche Antibody fagi-visualizzato

Published: January 17, 2015
doi:

Summary

Un metodo è descritto con accompagnamento visivo per lo svolgimento scalabili, selezioni elevati di throughput da combinatorie librerie di anticorpi sintetici fagi-mostrato contro centinaia di antigeni contemporaneamente. Usando questo approccio parallelo, abbiamo isolato frammenti anticorpali che presentano elevata affinità e specificità per diversi antigeni che sono funzionali in immunodosaggi standard.

Abstract

La richiesta di anticorpi che soddisfano le esigenze di applicazioni sia di ricerca di base e clinica è alta e aumenterà notevolmente in futuro. Tuttavia, è evidente che le tecnologie tradizionali monoclonali non sono soli fino a questo compito. Questo ha portato allo sviluppo di metodi alternativi per soddisfare la domanda di alta qualità e reagenti di affinità rinnovabili a tutti gli elementi accessibili del proteoma. A questo fine, i metodi high throughput per condurre le selezioni da librerie di anticorpi sintetici fagi-visualizzati sono stati ideati per applicazioni con diversi antigeni e ottimizzato per la velocità rapida e di successo. Qui, un protocollo è descritto in dettaglio che illustra con video dimostrativo la selezione parallela di cloni Fab-fago da librerie alte diversità contro centinaia di obiettivi utilizzando sia un gestore di liquido 96 canali manuale o sistema robotico automatizzato. Usando questo protocollo, un singolo utente può generare centinaia di antigeni,selezionare anticorpi a loro in parallelo e validare vincolante entro 6-8 settimane di anticorpi. Evidenziate sono: i) un formato antigene praticabile, ii) caratterizzazione dell'antigene preselezione, iii) passaggi critici che influenzano la scelta di specifiche e di alta cloni affinità, e iv) modi di efficacia selezione monitoraggio e tempestivamente clone anticorpo caratterizzazione. Con questo approccio, abbiamo ottenuto i frammenti di anticorpi sintetici (FAB) a molte classi di destinazione, tra cui i recettori single-pass di membrana, ormoni proteici secreti, e multi-dominio proteine ​​intracellulari. Questi frammenti sono facilmente convertiti in anticorpi full-length e sono stati convalidati per esibire elevata affinità e specificità. Inoltre, essi hanno dimostrato di essere funzionale in una varietà di immunodosaggi standard, tra cui Western blotting, ELISA, immunofluorescenza cellulari, immunoprecipitazione e saggi relativi. Questa metodologia accelerare la scoperta di anticorpi e infine ci avvicinano a realizzare l'obiettivo of generazione rinnovabili, anticorpi di alta qualità al proteoma.

Introduction

Con l'inizio dell'età post-genomica, la disponibilità dei reagenti vincolanti alta qualità per caratterizzare e modulare proteine ​​è essenziale per aprire nuove ricerche e vie terapeutiche. Anticorpi continuano ad essere fondamentale per entrambi i ricercatori accademici e industriali come la ricerca di base e gli strumenti diagnostici e potenziali terapie. Non sorprende, c'è stata una crescita impressionante di imprese di sviluppo di anticorpi contratto, la maggior parte dei quali si basano su tecnologie ibridomi convenzionali per generare anticorpi personalizzati. Tuttavia, la selezione in vitro utilizzando le librerie di anticorpi fagi-visualizzato sta diventando una potente tecnologia alternativa in grado di offrire vantaggi unici e di successo in cui le tecnologie convenzionali possono affrontare limitazioni 1, 2.

Alla luce della forte domanda per gli anticorpi di alta qualità come strumenti di ricerca, due sfide principali per la generazione di anticorpi rinnovabili sono: 1) la velocità di selezione e 2) av antigenevata disponibilità. Un certo numero di gruppi hanno ora descritto in gasdotti di selezione in vitro volti ad aumentare la produttività e il tasso di individuazione di anticorpi. Queste descrizioni particolare una varietà di approcci vitali che includono la selezione su o full-length obiettivi 3,4, o strutturalmente domini 5,6,7 correlato, utilizzando 6,8 o piatto a base di 3,4 schemi antigene immobilizzazione basati bead-. Inoltre, la crescente adozione di tecnologie di sintesi del gene 9 ha generazione sistematica antigene, in particolare di domini isolati, ragionevolmente conveniente e può potenzialmente alleviare la difficoltà di ottenere quantità sufficienti di purificato, antigeni full-length. Utilizzando le due tecnologie in tandem, una pipeline autonomo e generazione antigene scalabile e selezione anticorpo è stato ideato che consente l'isolamento parallelo di anticorpi per grandi insiemi di domini antigeni espressi e facilitare lo sviluppo di reagenti per characterizing intere classi di proteine ​​strutturalmente o funzionalmente collegate.

Verso questo obiettivo, una pipeline integrata che è stato sviluppato coppie in silico individuazione di domini antigene esprimibili, sintesi genica, espressione batterico high-throughput di antigeni e anticorpi selezioni scalabili fagi-visualizzato. Questo gasdotto richiede solo infrastrutture di base a disposizione la maggior parte dei laboratori di scienze della vita (comprese le biblioteche di anticorpi che sono sempre disponibili tramite licenza o trasferimento di materiale accordo), ma è anche suscettibile di automazione per l'utilizzo su scala industriale. Utilizzando questo protocollo, è possibile generare centinaia di domini antigene-tag di affinità e di routine isolare altamente specifici frammenti anticorpali a molti di questi antigeni.

Tecnologia di visualizzazione dei fagi ha dimostrato la compatibilità dimostrata con una vasta gamma di formati di reagenti affinità ricombinanti tra cui Fab, scFv, e domini autonomi Fv ecrescente schiera di piccoli 'quadri alternativi "(progettati proteine ​​ankyrin ripetizione (DARPINS), fibronectina (FN), domini lipocalina e più 10). La discussione è limitata in questo esempio per l'isolamento di frammenti anticorpali Fab, anche se si presume questi metodi possono essere adattati ad altri tipi di librerie. Grazie a questa tecnologia, Fabs con bassa affinità nanomolare piccolo, tagged domini proteici compresi settori fattore di trascrizione, i domini SH2,-RNA binding proteine ​​e altri sono stati selezionati con successo, molti dei quali legano la proteina full-length e sono funzionali in test immunologici quali immunofluorescenza , immunoprecipitazione ed immunoistochimica. È importante sottolineare che, cloni vincolanti ricombinanti sono completamente rinnovabili e possono essere rigenerati dalla espressione costruisce attraverso un'offerta produzione batterica maggiore coerenza, riproducibilità ed economicità, giustificando così la spesa di convalida clone rigorosa.

In questo protOcol e video di accompagnamento, sono dimostrati metodi di base per la selezione di anticorpi da librerie fagiche-visualizzato utilizzando domini antigene immobilizzati. Questo particolare metodo utilizza i domini di proteine ​​GST-tagged immobilizzati per adsorbimento passivo in micropiastra, anche se altri tag 11,12,13 e formati di selezione 13,14,2 sono stati utilizzati con successo. Considerazioni critiche per l'impostazione e lo svolgimento delle selezioni con monitoraggio parallelo di parametri di selezione volti a identificare e isolare anticorpi monoclonali specificamente arricchiti per la convalida sono dettagliati.

Protocol

1. Generation Antigen NOTA: i domini Antigen può essere sintetizzato e clonato da una varietà di fornitori commerciali a un adeguato espressione costrutto IPTG-inducibile. Trasforma costrutti di espressione in chimicamente competente, T1-fago resistente, BL21 E. coli di miscelazione 10 ng di DNA codificante in 20 ml di 1X KCM su ghiaccio in una piastra da 96 pozzetti PCR seguita dall'aggiunta di 20 L di cellule chimicamente competenti. Incubare la miscela …

Representative Results

Il protocollo qui descritto è stato usato per isolare frammenti anticorpali ad una varietà di entrambi i domini antigene strutturalmente e funzionalmente correlati da combinatori fago visualizzato librerie Fab in parallelo. Questioni relative alla disponibilità di antigene possono essere aggirate, in molti casi, per l'identificazione in silico di domini antigene esprimibili che sono adatti per la selezione di anticorpi 23. Accoppiando espressione dell'antigene alla selezione anticorpo nello stesso …

Discussion

Nel condurre nelle selezioni di anticorpi in vitro, i due fattori determinanti principali di successo di selezione sono: 1) l'isolamento di obiettivi antigeniche ben piegati, per la selezione su e 2) la disponibilità di una libreria di anticorpi diversità funzionale. In molti casi, la disponibilità di quantità sufficienti di ben piegata, proteina intera può essere limitante. Un approccio per superare questa limitazione è quello di utilizzare i domini individuati dall'analisi bioinformatic…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo riconoscere il Fondo comune NIH – proteine ​​reagenti acquisire il programma per finanziare lo sviluppo della selezione e caratterizzazione di anticorpi ricombinanti gasdotto anticorpo Network e la Fondazione canadese per l'innovazione per l'acquisto il finanziamento della piattaforma di selezione robotica.

Materials

MATERIALS
Name Company Catalog Number
New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker Eppendorf M1282-0004
Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system Anachem Ltd LIQ-96-200
Microplate shaker VWR 12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge Thermo Product 75004525
ELx405 Select Deep Well Microplate Washer Biotek ELX405USD
Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot S&P Robotics
Plastic conical Falcon tube: 50 mL VWR 21008-178
Plastic conical Falcon tube: 15 mL VWR 89039-668
Axygen 1.7 mL microcentrifuge tubes Corning MCT-175-L-C
96-well/384-well Maxisorp plate Sigma M9410-1CS
Corning 96-well V-bottom deep-well block Corning 3960
Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box Corning AXY-MTS-06-C-R-S
Breathable adhesive plate sealing film VWR 60941-084
REAGENTS
Name Company Catalog Number
polyethylene glycol Bioshop PEG800.1
yeast extract Bioshop YEX401.1
bio-tryptone Bioshop TRP402.1
N-Z amine Sigma C7290
glucose Sigma G8270-1KG
lactose Bioshop LAC234
glycerol Bioshop GLY001.500
carbenicillin  Bioshop CAR544.10
kanamycin Bioshop KAN201.25
tetracycline  Bioshop TET701.25
Tween 20 Bioshop TWN510.500
monobasic potassium phophate Bioshop PPM302.1
dibasic sodium phosphate Anachemia 84486-440
sodium chloride Bioshop SOD001.10
potassium chloride Bioshop POC308.1
calcium chloride Bioshop CCL302.500
magnesium sulphate EMD MX0070-1
magnesium chloride Bioshop MAG510.500
NH4Cl Amresco 0621-1KG
Na2SO4 Bioshop SOS513.500
agar Bioshop AGR001.500
SybrSafe DNA gel stain Invitrogen S33102
phosphoric acid Acros Organics 201140010
lysozyme Bioshop LYS702.25
benzonase Novagen 71205
Triton X-100 Bioshop TRX506.500
protease inhibitor cocktail tablets Roche 11 836 170 001
Ni-NTA resin  Qiagen 1018240
1000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per mL) NEB N0315S
HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). GE Healthcare 27-9241-01
TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate  KPL 50-76-00
dNTPs Biobasic DD0056
Taq polymerase Genscript E00007
Exonuclease GE Healthcare  EZ0073X-EZ
Shrimp alkaline phosphatase GE Healthcare E70092Z-EZ

References

  1. Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
  2. Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
  3. Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
  4. Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
  5. Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
  6. Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
  7. Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
  8. Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
  9. Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
  10. Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
  11. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
  12. Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
  13. Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
  14. Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
  15. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
  16. Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
  17. McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
  18. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  19. den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
  20. Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
  21. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S., Howard, G. C., MR, K. a. s. e. r. . Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 151-172 (2013).
  22. Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
  23. Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
  24. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
  25. Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).

Play Video

Citer Cet Article
Miersch, S., Li, Z., Hanna, R., McLaughlin, M. E., Hornsby, M., Matsuguchi, T., Paduch, M., Sääf, A., Wells, J., Koide, S., Kossiakoff, A., Sidhu, S. S. Scalable High Throughput Selection From Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries. J. Vis. Exp. (95), e51492, doi:10.3791/51492 (2015).

View Video