Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-
Summary
Um método é descrito com acompanhamento visual para a realização escaláveis, selecções de alto rendimento de bibliotecas combinatórias de anticorpos sintéticos exibidos em fagos contra centenas de antigénios simultaneamente. Usando esta abordagem paralela, isolámos fragmentos de anticorpos que exibem uma elevada afinidade e especificidade para diversos antígenos que são funcionais em imunoensaios convencionais.
Abstract
A demanda por anticorpos que atendam às necessidades de ambas as aplicações básicas e clínicas de pesquisa é alto e vai aumentar drasticamente no futuro. No entanto, é evidente que as tecnologias tradicionais não são monoclonais sozinho até esta tarefa. Isto conduziu ao desenvolvimento de métodos alternativos para satisfazer a procura de alta qualidade e reagentes de afinidade renováveis para todos os elementos acessíveis do proteoma. Para este fim, os métodos de alto rendimento para a realização de seleções a partir de bibliotecas de anticorpos sintéticos exibido em fagos foram concebidos para aplicações que envolvem diversos antígenos e otimizado para o rendimento e sucesso rápido. Nisto, um protocolo é descrito em detalhe que ilustra com demonstração de vídeo a selecção de clones paralelo Fab-fago a partir de bibliotecas de alta diversidade contra centenas de alvos quer utilizando um manipulador de líquidos 96 canal manual ou sistema de robótica automatizado. Usando este protocolo, um único usuário pode gerar centenas de antígenos,selecionar anticorpos para-los em paralelo e validar a ligação do anticorpo dentro de 6-8 semanas. Destacam-se: i) um formato de antígeno viável, ii) caracterização antígeno pré-selecção, iii) passos críticos que influenciam a seleção de clones específicos de afinidade e alta, e iv) formas de eficácia seleção monitoramento e fase inicial de anticorpos clone caracterização. Com esta abordagem, temos obtido os fragmentos de anticorpos sintéticos (FAB) para muitas classes alvo, incluindo os receptores de uma só passagem de membrana, hormônios proteína secretada e proteínas intracelulares multi-domínio. Estes fragmentos são facilmente convertidos em anticorpos de comprimento total e foram validados para apresentar uma elevada afinidade e especificidade. Além disso, eles têm sido demonstrados para ser funcional em uma variedade de imunoensaios convencionais, incluindo Western blot, ELISA, imunofluorescência celular, ensaios de imunoprecipitação e afins. Esta metodologia irá acelerar a descoberta de anticorpos e, finalmente, trazer-nos mais perto de realizar o objetivo of gerar anticorpos qualidade renováveis, elevadas para o proteoma.
Introduction
Com o início da era pós-genômica, a disponibilidade de reagentes de ligação de alta qualidade para caracterizar e modular proteínas é fundamental para abrir novas pesquisas e avenidas terapêuticas. Os anticorpos continuam a ser fundamentais para ambos os pesquisadores acadêmicos e industriais como a pesquisa básica e ferramentas de diagnóstico e terapêuticas potenciais. Não surpreendentemente, tem havido um crescimento impressionante de empresas de desenvolvimento de anticorpos contrato, a maioria dos que dependem de tecnologias de hibridoma convencionais para gerar anticorpos personalizados. No entanto, a seleção in vitro utilizando bibliotecas de anticorpos exibidos-fago está se tornando uma poderosa tecnologia alternativa que pode oferecer vantagens únicas e sucesso em que as tecnologias convencionais podem enfrentar limitações 1, 2.
À luz do que uma considerável procura de anticorpos de alta qualidade como ferramentas de investigação, dois desafios principais para a produção de anticorpos são renováveis 1) selecção de transferência e 2) av antigénioailability. Um certo número de grupos têm agora descrito em condutas de selecção in vitro com vista a aumentar o rendimento e a taxa de identificação de anticorpos. Estas descrições detalhe uma variedade de abordagens que incluem seleccionar viáveis em cima ou de comprimento completo como alvo 3,4, 5,6,7 ou domínios estruturalmente relacionado, usando 6,8 ou a placa de base de 3,4-regimes de antigénio de imobilização à base de grânulo. Além disso, o crescente adopção de tecnologias de síntese de genes 9 fez geração antigénio sistemática, particularmente de domínios isolados, razoavelmente custo eficaz e potencialmente pode aliviar a dificuldade na obtenção de quantidades suficientes de antigénio purificado, de comprimento completo. Ao utilizar as duas tecnologias em conjunto, um oleoduto auto-contido e geração antigénio escalável e selecção de anticorpos foi concebida que permita o isolamento de anticorpos para paralelo de grandes conjuntos de domínios de antigénios expressos e facilitar o desenvolvimento de reagentes para a characterizing classes inteiras de proteínas estruturalmente ou funcionalmente relacionados.
Para atingir esse objectivo, um pipeline integrado que casais em silico identificação de domínios de antigénio, a síntese de genes expressáveis, expressão bacteriana de alto rendimento de antigénios e selecções de anticorpo exibido em fagos tem sido desenvolvido escaláveis. Este gasoduto requer apenas infra-estrutura básica disponível para a maioria dos laboratórios de ciências da vida (incluindo bibliotecas de anticorpos que são cada vez mais disponíveis através de licença ou de transferência de material acordo), mas também é passível de automação para uso em escala industrial. Usando este protocolo, é possível gerar centenas de domínios de antigénio marcado com afinidade, e rotineiramente isolar fragmentos de anticorpos altamente específicos para muitos destes antigénios.
A tecnologia de apresentação de fagos demonstrou compatibilidade demonstrado com uma ampla variedade de formatos de reagentes de afinidade recombinantes incluindo Fab, scFv, Fv e domínios autónomos e umcrescente conjunto de pequenos 'estruturas alternativas' (proteínas ankyrin repetição projetados (DARPINS), fibronectina (FN), domínios lipocalina e mais 10). Discussão é limitado neste exemplo para o isolamento de fragmentos de anticorpos Fab, embora se presume estes métodos podem ser adaptados a outros tipos de bibliotecas. Utilizando esta tecnologia, os Fabs com baixa afinidade nanomolar para pequeno, marcaram domínios proteicos, incluindo domínios de factor de transcrição, domínios SH2, proteínas e outros ligação RNA foram seleccionadas com sucesso, muitos dos quais se ligam a proteína de comprimento completo e são funcionais em imunoensaios tais como imunofluorescência , imunoprecipitação e imuno-histoquímica. Importante, clones de ligação recombinantes são totalmente renovável e pode ser re-gerada a partir de construções de expressão via oferta de produção bacteriana maior coerência, reprodutibilidade e custo-efetividade, justificando, assim, a despesa de validação clone rigorosa.
Neste protOCOL e vídeo acompanhante, métodos básicos para a selecção de anticorpos a partir de bibliotecas exibidas em fagos utilizando domínios de antigénios imobilizados são demonstradas. Este método particular emprega domínios de proteínas marcadas com GST imobilizados por adsorção passiva em placas de micropoços, embora outras marcações 11,12,13 13,14,2 e formatos de selecção, também têm sido utilizados com sucesso. Considerações críticas para a instalação e condução das seleções com acompanhamento paralelo de parâmetros de seleção que visam identificar e isolar anticorpos clonais especificamente enriquecido para validação são detalhados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ao conduzir em selecções de anticorpos in vitro, os dois principais determinantes do sucesso selecção são 1) o isolamento de alvos antigénicos bem dobradas para a selecção em cima e 2) a disponibilidade de uma biblioteca de anticorpos de alta diversidade funcional. Em muitos casos, a disponibilidade de quantidades suficientes de bem-dobradas, proteína de comprimento completo pode ser limitante. Uma abordagem para superar esta limitação é a utilização de domínios identificados a partir da…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer o Fundo Comum do NIH – Protein Programa de reagentes de captura para financiar o desenvolvimento da seleção anticorpo recombinante e caracterização gasoduto Antibody Rede e da Fundação Canadense para Inovação para a compra financiamento da plataforma seleção robótico.
Materials
| MATERIALS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 mL | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 mL | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per mL) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ | |
References
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S., Howard, G. C., MR, K. a. s. e. r. . Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
