यहाँ वर्णित प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख अनाथ जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) के कार्यात्मक को सक्रिय ligand (ओं) की पहचान के लिए एक मध्यम throughput रिवर्स औषध विज्ञान स्क्रीनिंग प्रणाली है.
20 से अधिक वर्षों के लिए, रिवर्स औषध अनाथ जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) के सक्रिय करने ligands को खोजने के लिए preeminent रणनीति रही है. एक रिवर्स औषध विज्ञान परख की शुरुआत एक सेलुलर अभिव्यक्ति प्रणाली में ब्याज की एक GPCR की क्लोनिंग और बाद अभिकर्मक है. heterologous व्यक्त रिसेप्टर तो रिसेप्टर को सक्रिय ligand (ओं) की पहचान करने के लिए उम्मीदवार ligands की एक यौगिक पुस्तकालय के साथ चुनौती दी है. रिसेप्टर सक्रियण कैल्शियम या शिविर की तरह दूसरा दूत संवाददाता अणुओं की एकाग्रता में परिवर्तन को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. यहाँ वर्णित प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख एक बार इस्तेमाल मध्यम throughput के औषध विज्ञान परख रिवर्स है. अनाथ GPCR transiently मानव भ्रूण गुर्दे 293T (HEK293T) कोशिकाओं में व्यक्त की है और एक अनेक Gα 16 निर्माण सह ट्रांसफ़ेक्ट है. Ligand बाध्यकारी बाद, Gα 16 सबयूनिट की सक्रियता कैल्शियम च की रिहाई लातीजालिका रोम. पिछले ligand स्क्रीनिंग के लिए, रिसेप्टर व्यक्त कोशिकाओं एक फ्लोरोसेंट कैल्शियम सूचक, Fluo 4 acetoxymethyl से भरी हुई हैं. Fluo 4 के फ्लोरोसेंट संकेत विश्राम परिस्थितियों में कोशिकाओं में नगण्य है, लेकिन रिसेप्टर सक्रियण के बाद जारी किए हैं कि कैल्शियम आयनों के साथ बातचीत पर एक 100 गुना से भी अधिक परिलक्षित किया जा सकता. वर्णित तकनीक ट्रांसफ़ेक्ट आनुवंशिक सामग्री मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत है जिसमें stably ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइनों का समय लेने वाली स्थापना की आवश्यकता नहीं है. इसके बजाय, एक क्षणिक अभिकर्मक, लक्ष्य जीन की अस्थायी अभिव्यक्ति, सृजन स्क्रीनिंग परख करने के लिए पर्याप्त है. सेटअप यौगिकों के सैकड़ों के मध्यम throughput प्रदर्शन की अनुमति देता है. सबसे GPCRs के लिए जोड़े, चाहे अंतर्जात SETT में देशी संकेतन मार्ग की, intracellular संकेतन मार्ग कैल्शियम की रिहाई की दिशा में निर्देशित कर दिये जाने की अनुमति देता है, जो अनेक Gα 16, सह अभिकर्मकबैठकों. HEK293T कोशिकाओं को संभालना आसान कर रहे हैं और रिसेप्टर deorphanization assays में साल भर में अपनी क्षमता को साबित किया है. हालांकि, विशिष्ट रिसेप्टर्स के लिए परख का अनुकूलन आवश्यक रह सकती है.
जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) सभी सेल सतह प्रोटीन के बीच सबसे बड़ा और सबसे विविध परिवारों में से एक का गठन. रीढ़ में उनकी उपस्थिति, अकशेरूकीय, पौधों, खमीर, और कीचड़ ढालना है, साथ ही प्रोटोजोआ और जल्द से जल्द डिप्लोब्लासटिक में Metazoa GPCRs संकेत पारगमन 1 के साथ जुड़ा हुआ सबसे पुराना अणुओं के बीच में हैं कि इंगित करता है. उनके प्राकृतिक सक्रिय करने ligands पेप्टाइड्स, biogenic amines, odorants, ग्लाइकोप्रोटीन, और फोटॉनों 2 सहित बाहरी उत्तेजनाओं की एक विस्तृत विविधता शामिल है. जैसे, इन रिसेप्टर ligand संकेतन सिस्टम शारीरिक प्रक्रियाओं के एक महान विविधता में शामिल हैं. व्यापक कार्यात्मक स्पेक्ट्रम मानव रोगों की एक विस्तृत रेंज को कवर कि चिकित्सीय औषधियों के विकास के लिए उन्हें आदर्श अनुकूल बनाता है. वर्तमान दवा लक्ष्य के बारे में 50-60% GPCRs 3,4 द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. दवा उद्योग में उनके महान महत्व के अलावा, GPCRs एक के विकास के लिए सुर्खियों में भी कर रहे हैंसामान्य रूप में प्रजातियों विशिष्ट कीटनाशकों 5,6 और कीटनाशकों की नई पीढ़ी. कई GPCRs की प्राकृतिक ligands अभी भी अज्ञात होते हैं, क्योंकि वे अनाथ GPCRs के रूप में वर्गीकृत किया जाता है. इन रिसेप्टर्स की deorphanization जीवों में उनके शारीरिक भूमिकाओं की समझ में सुधार होगा और नई दवा आवेदन पत्र 7 के लिए ख्यात लक्ष्य को उजागर कर सकते हैं.
जीनोमिक युग के बाद से, रिवर्स औषध विज्ञान रणनीति व्यापक रूप से GPCRs 8 deorphanization के लिए लागू किया जाता है. दृष्टिकोण एक अनाथ रिसेप्टर 'मछली बाहर' करने के लिए एक 'हुक' एक जैविक निकालने से या सिंथेटिक यौगिकों का एक पुस्तकालय से अपने को सक्रिय ligand के रूप में प्रयोग किया जाता है कि निकलता है. ब्याज की GPCR इसलिए क्लोन और बाद में एक सेलुलर अभिव्यक्ति प्रणाली में ट्रांसफ़ेक्ट है. सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों में, रिसेप्टर सक्रियण दूसरा दूत अणुओं की एकाग्रता में बदलाव को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है 9 </sup>. मुख्य रिसेप्टर स्क्रीनिंग assays (जैसे, aequorin) 10 या फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक (जैसे, Fluo 4) 11 कैल्शियम के प्रति संवेदनशील bioluminescent प्रोटीन पर निर्भर हैं. रिसेप्टर व्यक्त कोशिकाओं पूर्व ligand स्क्रीनिंग के लिए एक फ्लोरोसेंट कैल्शियम सूचक के साथ लोड कर रहे हैं जिसमें प्रतिदीप्ति आधारित assays, वे कारण उपयोग, कम पढ़ने के समय के उनके आराम करने के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग की अनुमति है कि लाभ, और स्क्रीनिंग का लचीलापन है एक ही थाली 12 पर कई अनाथ रिसेप्टर्स.
इधर, प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख अच्छी तरह से वर्णित है और ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर कम neuropeptide एफ (sNPF) रिसेप्टर की deorphanization प्रक्रिया से यह साफ है. इस neuropeptidergic सिगनल प्रणाली मूल रूप से Mertens एट अल द्वारा विशेषता थी. 2002 में चीनी हम्सटर अंडाशय (चो) कोशिकाओं में प्रदर्शन एक कैल्शियम bioluminescence परख के साथ 1314 और द्वारा फेंग एट अल. 2003 में उपयोग करते हुए एक electrophysiological परख के साथ Xenopus 15 oocytes. sNPF सिगनल प्रणाली की मौजूदगी इसे खिला, विकास, तनाव प्रतिक्रियाओं, हरकत, और circadian लय 16 के नियमन सहित प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में फंसा है, जहां आर्थ्रोपोड़ा, की जाति तक सीमित किया जा रहा है.
कीड़ों में neuropeptidergic संकेतन सिस्टम पर रिसर्च ही कीटनाशकों के विकास के लिए नए लक्ष्य के लिए नेतृत्व नहीं कर सकते, लेकिन उनके कामकाज के ज्ञान के रूप में भी कई संकेत प्रणाली आम तौर पर अच्छी तरह से विकास 17 भर में संरक्षित किया गया है अन्य जीवों के प्रति extrapolated किया जा सकता है. पिछले दशक में, महान प्रगति कीट neuropeptide GPCRs की deorphanization प्रक्रिया में किया गया है. इन प्रयासों के बावजूद, रिसेप्टर्स की केवल एक छोटा सा संख्या में उनके आत्मीय ligand करने के लिए मिलान, और अनुक्रम जानकारी के भार के लिए कर दिया गया हैनई अनाथ GPCRs कारण जीनोमिक्स 18 के तेजी के लिए उपलब्ध हो गया है. एक व्यापक रूप से लागू तकनीक 9,18 साबित हो गया है कि प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख जैसे मध्यम / उच्च throughput स्क्रीनिंग दृष्टिकोण, की उपलब्धता, इसलिए अमूल्य है.
यहाँ वर्णित के रूप में प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख मानव भ्रूण गुर्दे 293T (HEK293T) सेल लाइन में प्रदर्शन किया और रिसेप्टर सक्रियण पर intracellular कैल्शियम की सांद्रता में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए एक फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करता है. उच्च अभिव्यक्ति और रिसेप्टर के अनुवाद के स्तर की गारंटी करने के लिए, एक कोज़ाक आम सहमति अनुक्रम 19 बाद में एक अभिव्यक्ति वेक्टर (स्तनधारी सेल लाइनों के लिए जैसे, pcDNA वेक्टर श्रृंखला) में क्लोन है जो रिसेप्टर कोडन अनुक्रम, के 5 'अंत में जोड़ा जाता है. यह क्रम सूचना के आधार पर एक अनाथ GPCR की अंतर्जात जी प्रोटीन युग्मन की भविष्यवाणी करना मुश्किल है जैसाअकेले, रिसेप्टर सक्रियण के बाद संग्राहक हैं कि दूसरा दूत अणुओं (जैसे, कैल्शियम या शिविर) अक्सर पूर्व ligand पहचान करने के लिए अनजान रहते हैं. इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, सबसे GPCRs के साथ बातचीत और कहा कि जी क्यू परिवार (जैसे, murine Gα 15 या [यहां इस्तेमाल] मानव Gα 16) या chimeric जी प्रोटीन (जैसे, Gα qi5) के अनेक जी प्रोटीन कैल्शियम की रिहाई पैदा कर सकते हैं 20,21,22 सह व्यक्त किया. इसके रिसेप्टर ligand के बंधन पर, GPCR विशिष्ट intracellular रास्ते की सक्रियता की ओर जाता है कि एक गठनात्मक बदलाव आए. Gα 16 सबयूनिट को आराम की शर्तों के तहत बाध्य ग्वानोसिन diphosphate (जीडीपी) अणु, एक ग्वानोसिन triphosphate (जीटीपी) अणु द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा. यह एक Gα 16 और Gβγ सबयूनिट में heterotrimeric जी प्रोटीन की हदबंदी भड़काती. Gα 16 सबयूनिट phospholipase सी और सक्रिय हो जाता है# 946; बदले में झिल्ली ही सीमित diacylglycerol में जिसके परिणामस्वरूप phosphatidylinositol बाइफोस्फेट (रंज 2) (डेग) और inositol trisphosphate (आईपी 3) hydrolyzes जो (PLCβ),. आईपी 3 cytoplasm भर में फैला है और कोशिका द्रव्य में कैल्शियम की रिहाई लाती है जो जालिका, की झिल्ली में मौजूद आईपी 3 निर्भर कैल्शियम चैनल को सक्रिय करेंगे.
रिसेप्टर सक्रियण पर कैल्शियम रिहाई सेकंड के भीतर होता है और Fluo 4 acetoxymethyl (AM) 11 तरह, एक कैल्शियम के प्रति संवेदनशील डाई के साथ स्क्रीनिंग परख से पहले कोशिकाओं लोड करके पता लगाया जा सकता है. AM एस्टर समूह कोशिका झिल्ली को पार करने के लिए फ्लोरोफोरे सक्षम बनाता है और एक बार सेल के अंदर cytoplasmic esterases द्वारा बंद cleaved है. नतीजतन, फ्लोरोसेंट डाई के नकारात्मक आरोप सेल के बाहर diffusing और यह कैल्शियम आयनों के साथ बातचीत करने की अनुमति से रोकने, बेपर्दा कर रहे हैं. फ्लोरोसेंट संकेत ओच Fluo 4 केवल nanomolar रेंज में कैल्शियम की सांद्रता युक्त विश्राम परिस्थितियों में कोशिकाओं में नगण्य है. कैल्शियम रिसेप्टर सक्रियण पर जारी की है हालांकि, जब संकेत एतद्द्वारा एक बड़ा संकेत करने वाली शोर अनुपात सुनिश्चित करने, अधिक से अधिक 100 गुना करने के लिए एकाग्रता-dependently बढ़ा सकते हैं. Fluo 4 भी कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में physiologically प्रासंगिक कैल्शियम परिवर्तन को मापने के लिए यह उपयुक्त बनाने, 345 एनएम के एक कश्मीर (डी कैल्शियम) के आसपास [कैल्शियम] रिपोर्टिंग के लिए एक बड़ी गतिशील रेंज दर्शाती है. Fluo 4 की उत्तेजना 488 एनएम पर होता है और उत्सर्जन प्रतिदीप्ति 525 एनएम 11 पर मापा जाता है. प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्लेट पाठक (FLIPR) 23, NOVOstar, या FlexStation (स्टेशन डिवाइस) 12 तरह Fluorimeters हर अच्छी तरह से करने के लिए एक साथ मिश्रित अलावा और रिसेप्टर सक्रियण पर Fluo 4 संकेत का पता लगाने की अनुमति है कि मध्यम / उच्च throughput व्यवस्था कर रहे हैं एक परख थाली में. यहाँ वर्णित कैल्शियम जुटाना परख स्टेशन पर निर्भर करता हैडिवाइस 96 अच्छी तरह से microplate प्रणाली.
SoftMax प्रो सॉफ्टवेयर (सॉफ्टवेयर) के आंकड़ों के विश्लेषण के लिए और साथ ही स्टेशन डिवाइस संचालित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कार्यक्रम तुरंत 96 अच्छी तरह प्रारूप में रेखांकन के रूप में परिणाम प्रदर्शित करता है. एकाधिक कुओं ही ग्राफ पर इन कुओं के परिणाम की तुलना करने के लिए एक साथ चुना जा सकता है. प्रत्येक स्तंभ में कुओं के रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाई (RFU) मानों एक साथ वेल्स को यौगिकों के अलावा पहले शुरू करने और रिसेप्टर सक्रियण के बाद फ्लोरोसेंट संकेत की माप के बाद जारी, दो मिनट की अवधि के लिए मापा जाता है. एक सक्रिय यौगिक फ्लोरोसेंट संकेत की एक तेजी से वृद्धि हुई है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं को जोड़ा जाता है जब तक आम तौर पर, एक agonist वक्र की प्रवृत्ति आधार रेखा के साथ संरेखित करता है. शिखर ऊंचाई कुएं में अंतिम agonist एकाग्रता के साथ जोड़ा जाता है. शिखर के बाद, फ्लोरोसेंट संकेत धीरे धीरे आधारभूत स्तर की ओर चला जाता है. RFU माप सीएN एक ligand के चुनाव आयोग 50 मूल्य (आधा अधिक से अधिक प्रभावी एकाग्रता) निर्धारित करने के लिए एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता में परिवर्तित किया. सामान्य में, कम से कम तीन स्वतंत्र स्क्रीन, एक एकाग्रता श्रृंखला की तीन प्रतिकृतियां सहित प्रत्येक, एक विश्वसनीय एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र शांत करने के लिए किया जाना चाहिए.
यह प्रयोगात्मक डिजाइन में कई सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शामिल करने के लिए सिफारिश की है. सबसे पहले, एक अभिकर्मक नियंत्रण, एक ज्ञात ligand के साथ एक रिसेप्टर के कार्यान्वयन यानी, परीक्षण किया जाना चाहिए. इस अभिकर्मक एजेंट परिचालन किया गया था कि क्या की पुष्टि करने की अनुमति देता है. सेल लाइन और एक नकारात्मक नियंत्रण (जैसे, धोने बफर) के एक अंतर्जात रिसेप्टर के लिए एक agonist के साथ एक नियंत्रण प्रयोग का समावेश भी कोशिकाओं के स्वास्थ्य और व्यवहार्यता पर नजर रखने के लिए और धोने बफर के साथ दूषित था कि संभावना को बाहर करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं एक ऑटो fluore बटोर सकता है कि एक कारकखुशबू प्रतिक्रिया. अक्सर इस्तेमाल एगोनिस्ट acetylcholine रिसेप्टर को सक्रिय करता है जो एक सममूल्य 1 चयनात्मक एगोनिस्ट, या carbachol, के रूप में कार्य करता है जो प्रोटीज सक्रिय रिसेप्टर -1 (PAR 1), से व्युत्पन्न एक पेप्टाइड हैं. एक खाली अभिव्यक्ति वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को भी सक्रिय यौगिकों सेल की अंतर्जात रिसेप्टर्स के साथ बातचीत है कि बाहर करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. नीचे प्रोटोकॉल में वर्णित कई मानकों के अनुकूलन अलग संकेतन सिस्टम के लिए आवश्यक हो सकता है. पूरा प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख का एक योजनाबद्ध चित्रा चित्र 1 में दिखाया गया है.
प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख की चित्रा 1. समग्र योजना. स्वचालित तरल हैंडलिंग और एक साथ प्रतिदीप्ति माप स्टेशन के साथ प्रदर्शन कर रहे हैंसॉफ्टवेयर के द्वारा संचालित डिवाइस microplate रीडर,. सेल प्लेट के लिए एक मिश्रित थाली और टिप रैक: स्टेशन युक्ति तीन दराज होता है. निर्माण में pipettor स्थानान्तरण मिश्रित थाली के एक स्तंभ से सेल प्लेट (चरण 1) के संगत स्तंभ के लिए यौगिकों. सेल प्लेट की हर अच्छी तरह से ब्याज की GPCR और अनेक Gα 16 सबयूनिट के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है कि HEK293T कोशिकाओं की एक monolayer होता है. एक यौगिक रिसेप्टर को सक्रिय करते हैं, Gα 16 बाध्य सकल घरेलू उत्पाद जीटीपी की जगह है. Gα 16 सबयूनिट बाद Gβγ परिसर से dissociates और बदले में phosphatidylinositol बाइफोस्फेट (रंज 2) diacylglycerol (डेग) और inositol trisphosphate (आईपी 3) में जिसके परिणामस्वरूप hydrolyzes जो phospholipase Cβ (PLCβ), सक्रिय. आईपी 3 कैल्शियम INT की रिहाई उत्प्रेरण, जालिका की झिल्ली में मौजूद आईपी 3 निर्भर कैल्शियम चैनल को सक्रिय करता हैकोशिका द्रव्य ओ. Fluo 4 (कोशिकाओं अलावा मिश्रित करने के लिए पूर्व लोड कर रहे हैं जिसके साथ) के साथ कैल्शियम की बातचीत एक फ्लोरोसेंट संकेत (चरण 2) में यह परिणाम है. सॉफ्टवेयर रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाई समय के समारोह में (RFU) मान के रूप में परिणाम प्रस्तुत करता है, और चोटी ऊंचाइयों एक एकाग्रता पर निर्भर ढंग से ligand एकाग्रता के साथ सहसंबंधी. ये आंकड़े तो एक ligand रिसेप्टर जोड़ी (कदम 3) के चुनाव आयोग 50 मूल्य निर्धारित करने के लिए एक एकाग्रता प्रतिक्रिया की अवस्था में परिवर्तित किया जा सकता है.
प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख सफलतापूर्वक पहले से ही Mertens एट अल द्वारा किया गया था जो ड्रोसोफिला sNPF पेप्टिडर्जिक सिगनल प्रणाली के कार्यात्मक विशेषता पुष्टि करने के लिए लागू किया गया था. एक bioluminescence परख के साथ और फेंग एट अल द्वारा. एक electrophysiological परख 13,15 साथ. Drome-sNPF-; Fluo = 2.04 एनएम, LUMI = 51 एनएम: HEK293T कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति परख के साथ प्राप्त की चुनाव आयोग 50 मूल्यों के बारे में चो कोशिकाओं (Drome-sNPF -1 में प्रदर्शन bioluminescence परख के साथ प्राप्त की तुलना में कम से कम 10 गुना कर रहे हैं 2: Fluo = 5.89 एनएम, LUMI = 42 एनएम; Drome-sNPF-3: Fluo = 5.55 एनएम, LUMI = 31 एनएम; Drome-sNPF-4: Fluo = 0.50 एनएम, LUMI = 75 एनएम). इन बदलावों का इस्तेमाल किया अभिव्यक्ति प्रणालियों में से एक एक दिया रिसेप्टर के कार्यात्मक अभिव्यक्ति के लिए बेहतर अनुकूल हो सकता है, या कुछ रिसेप्टर्स की तह सी में कम कुशल हो सकता है कि तथ्य यह सहित कई कारकों से समझाया जा सकता हैertain प्रकार की कोशिकाओं. आम तौर पर इन विवो में उनके पेप्टाइड रिसेप्टर बातचीत की शारीरिक प्रासंगिकता समर्थन, प्रतिदीप्ति और bioluminescence परख दोनों के साथ उनके रिसेप्टर पर परीक्षण किया जब सभी चार Drome-sNPF पेप्टाइड्स के चुनाव आयोग 50 मूल्यों nanomolar रेंज में हैं.
ड्रोसोफिला sNPF सिगनल प्रणाली सामान्य रूप से प्रयोगात्मक setups में अभिकर्मक नियंत्रण है क्योंकि सक्रिय करने ligand में जाना जाता है, जिसके लिए एक रिसेप्टर के साथ कोई अभिकर्मक नियंत्रण, यहाँ प्रस्तुत स्क्रीन में शामिल किया गया था कि ध्यान दें. HEK293T कोशिकाओं (PAR 1) और नकारात्मक नियंत्रण (धोने बफर) के एक अंतर्जात ligand के साथ सकारात्मक नियंत्रण स्क्रीन में शामिल थे. PAR 1 के परिणामों कोशिकाओं को एक अच्छी हालत में थे कि पता चला है. नकारात्मक नियंत्रण (बफर धोने) पेप्टाइड्स भंग कर रहे हैं, जिसमें मध्यम inf सकता है कि किसी भी contaminants से मुक्त किया गया है कि जो इंगित करता है, एक फ्लोरोसेंट संकेत नहीं बटोरपरिणाम luence.
पहले से विशेषता ड्रोसोफिला sNPF सिगनल प्रणाली प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख की व्याख्या करने के लिए यहां इस्तेमाल किया गया था. इस प्रयोजन के लिए सक्रिय करने ligands की एकाग्रता श्रृंखला तुरंत परीक्षण किया गया. एक अनाथ रिसेप्टर यौगिकों के सैकड़ों युक्त एक पुस्तकालय का परीक्षण करने के लिए एक स्क्रीनिंग परख में overexpression लिए लाया जाता है हालांकि, जब यह ligands (जैसे., 10 या 1 माइक्रोन) के अपेक्षाकृत उच्च अंतिम सांद्रता के साथ पहली बार परदे की सिफारिश की है. एक सक्रिय यौगिक का पता लगाने के बाद, कि परिसर के एक कमजोर पड़ने श्रृंखला एक एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र रचना करने और चुनाव आयोग 50 मूल्य निर्धारित करने के लिए जांच की जा सकती है.
एक रिसेप्टर की सक्रिय करने ligand निर्धारित किया जाता है एक बार, intracellular संकेतन मार्ग आगे प्रोटोकॉल आदत डाल द्वारा जांच की जा सकती है. परख ऊपर वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया, लेकिन जी सह transfecting बिना ^ जा सकता है5, 16 सबयूनिट. एक कैल्शियम प्रतिक्रिया मापा जाता है, तो इसका मतलब है कि रिसेप्टर सेलुलर अभिव्यक्ति प्रणाली का एक अंतर्जात Gα क्ष सबयूनिट के साथ जोड़े. कोई फ्लोरोसेंट संकेत मनाया जाता है, अन्य माध्यमिक दूत (जैसे., शिविर) की सांद्रता में परिवर्तन को मापने के लिए प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है.
संरचना गतिविधि संबंध (एसएआर) पढ़ाई भी रिसेप्टर सक्रियण के लिए आवश्यक पेप्टाइड के मुख्य अनुक्रम को परिभाषित करने के लिए किया जा सकता है. पहला, छोटा दृश्यों अभी भी रिसेप्टर को सक्रिय करने में सक्षम है कि पेप्टाइड का न्यूनतम अमीनो एसिड अनुक्रम को परिभाषित करने के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं. अगला, पेप्टाइड्स व्यवस्थित ढंग से हर एमिनो एसिड एक alanine अवशेषों के लिए प्रतिस्थापित किया गया है जो में परीक्षण किया जा सकता है. रिसेप्टर पर सिंथेटिक alanine प्रतिस्थापन श्रृंखला का परीक्षण रिसेप्टर सक्रियण 24,25 के लिए अमीनो एसिड में से प्रत्येक के महत्व को निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है.
इसके लगातार उपयोग और साबित effi के बावजूदcacy, यह यहाँ वर्णित परख हित के विशिष्ट रिसेप्टर्स के लिए अधिकतम परिणाम हासिल करने के लिए कुछ रूपांतरों की आवश्यकता हो सकती है कि बल दिया जाना है. Gα 16 सबयूनिट यह सबसे GPCRs को बांधता है कि लाभ दिया है, लेकिन यह भी रिसेप्टर्स पर एक प्रमुख नकारात्मक प्रभाव हो सकता है कि endogenously Gα क्यू 22 के माध्यम से जोड़े. इस मामले में, यह एक उपन्यास कैल्शियम परख के अनुकूलन के दौरान जी प्रोटीन के विभिन्न संयोजनों का परीक्षण करने और Gα 16 की अनुपस्थिति या उपस्थिति में Gα क्ष युग्मित रिसेप्टर्स के लिए परिणामों की तुलना करने के लिए उपयोगी हो सकता है. रिसेप्टर सक्रियण पता लगाने के लिए बातचीत जी प्रोटीन से सम्बंधित वैकल्पिक assays भी ऐसी GFP लेबल arrestin के स्थानान्तरण, या झिल्ली क्षमता (उदाहरण., FLIPR झिल्ली क्षमता परख किट द्वारा) में परिवर्तन का पता लगाने के रूप में, प्रदर्शन किया जा सकता है. Fluo 4 बजे, यहाँ अन्य कैल्शियम के प्रति संवेदनशील fluorophores की एक विस्तृत सरणी, अपने स्वयं के वर्णक्रमीय और chemic के साथ प्रत्येक प्रयोग किया जाता है इसके अलावाअल गुण, उपलब्ध है. सबसे उपयुक्त फ्लोरोफोरे GPCR, सेल प्रकार और उपलब्ध प्लेट रीडर के आधार पर चुना जा सकता है, लेकिन प्रयोगात्मक सत्यापन आवश्यक है. ट्रांसफ़ेक्ट डीएनए और प्रत्येक रिसेप्टर अभिकर्मक अभिकर्मक सेल लाइन संयोजन के लिए निर्धारित किया जा करने के लिए डीएनए / अभिकर्मक अभिकर्मक अनुपात की जरूरत के बराबर है. अंत में, यह निरंतर संस्कृति में कोशिकाओं केवल 20-25 प्रयोग करने योग्य मार्ग स्क्रीनिंग assays प्रदर्शन करने की अनुमति है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों रिसर्च फाउंडेशन फ़्लैंडर्स (FWO-Vlaanderen, बेल्जियम, G.0601.11) और यू लोवेन रिसर्च फाउंडेशन GOA/11/002 को स्वीकार करते हैं. FWO-Vlaanderen से एक फैलोशिप से आईबी, टी जे और लेफ्टिनेंट लाभ.
HEK293T cells | |||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Trypsin-EDTA solution (0.25%) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | MP Biomedicals | 195173 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Penicillin-Streptomycin (P-S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
jetPRIME | Polyplus transfection | 114-01 | FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Life technologies) |
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392 | |
Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
Reagent A100, Lysis buffer | Chemometec | 910-0003 | |
Reagent B, Stabilizing buffer | Chemometec | 910-0002 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
HBSS buffer: Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
NaOH (1 M) | Vel | 2781 | |
Pluronic acid | Invitrogen | P-3000MP | |
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen) |
TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150) | Sigma-Aldrich | Z707503 and Z707554 | |
FlexStation device | Molecular Devices | NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices) | |
Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom | Greiner Bio-One | 655090 | Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | ||
Microcentrifuge tubes, siliconized | BioCision | BCS-2470 | |
Polystyrene V-shaped 96-well plates | Greiner Bio-One | 651101 | |
96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
Soft Max Pro software | Molecular Devices |