두 광자<em> 생체</em> 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상
Summary
Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.
Abstract
포유류의 피질에서 신경 세포는 매우 복잡한 네트워크와 시냅스에서 정보 교환을 형성한다. 시냅스 강도뿐만 아니라, 시냅스의 추가 / 제거의 변화, 신경 가소성의 구조적 기초를 제공하고, 환경 의존적으로 발생한다. 피질에서 가장 흥분성 시냅스의 시냅스 구성 요소로, 돌기 쪽은 시냅스의 좋은 프록시로 간주됩니다. 마우스 유전학과 형광 라벨 기법, 개별 뉴런과 자신의 시냅스 구조의 촬영 장점은 그대로 뇌에 표시 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생체 내에서 시간이 지남에 형광 표지 시냅스 돌기 쪽을 따라 두 광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 두개 영상 프로토콜을 소개합니다. 이 프로토콜은 그대로 두개골을 유지하고 수막의 노출과 피질에 의한 염증 효과를 방지 얇게 두개골 준비를 활용합니다. 따라서, 이미지는 SU 직후에 취득 할 수있다rgery이 수행된다. 실험 절차는 시간부터 년까지 다양한 시간 간격들에 걸쳐 반복하여 수행 될 수있다. 이 혼합물을 또한 생리적 및 병리 적 조건에서, 다른 피질 영역과 층뿐만 아니라, 다른 세포 유형을 조사하기 위해 확장 될 수있다.
Introduction
포유류의 피질 감각 지각과 운동 제어에서 추상적 인 정보 처리 및 인식, 많은 뇌 기능에 참여하고 있습니다. 다양한 대뇌 피질의 기능은 신경 세포의 다른 종류의 통신 및 개별 시냅스에서 정보를 교환하기로 구성되어 다른 신경 회로에 구축 할 수 있습니다. 시냅스의 구조 및 기능은 일관 경험 및 병리에 대한 응답으로 수정되고있다. 성숙한 뇌에서 시냅스 가소성 형성과 기능적 신경 회로의 유지에 중요한 역할을 수행, 강도 변화와 시냅스의 추가 / 제거를 두의 형태를 취한다. 돌기 쪽은 포유류 뇌의 흥분성 시냅스의 대부분의 시냅스 구성 요소입니다. 지속적인 매출 및 척추의 형태 학적 변화는 시냅스 연결 1-7 수정의 좋은 지표 역할을 것으로 추정된다.
이광자 레이저 스캐닝 마이크로SCOPY 두꺼운 불투명 준비하고 그대로 뇌 8 라이브 영상에 적합하게 낮은 광독성을 통해 깊은 침투를 제공합니다. 형광 표시와 함께, 두 광자 영상은 살아있는 뇌 들여다 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 개별 시냅스의 구조 개편을 수행 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다. 다양한 방법은 실시간 이미징 9-13 생쥐를 제조하는데 사용되었다. 여기, 우리는 마우스 피질에서 시냅스 돌기 쪽의 구조적 가소성을 조사하기 위해 생체 내 두 광자 이미징 얇게 두개골 준비에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하여, 우리의 최근의 연구는 형광 표지 된 신경 세포의 하위 집합 및 생체 표지 기술의 급속한 발전과 함께 형질 전환 동물의 증가 가용성 학습 운동 기능에 대한 응답으로 돌기 척추 변화의 동적 인 그림을 묘사 한, 여기에 설명 된 절차와 유사한 절차도 적용 할 수 있습니다 investiga하기TE 다른 세포 유형 및 피질 영역, 다른 조작과 결합뿐만 아니라, 16-23은 질병 모델에서 사용했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
성공적인 얇게 두개골 준비를 얻으려면,이 프로토콜의 몇 가지 단계가 매우 중요하다. 1) 두개골의 두께. 두개골 뼈이 고밀도 치밀골의 층과 저밀도 해면골의 중간층과 함께 샌드위치 구조를 갖는다. 고속 마이크로 드릴 치밀골과 해면골의 외부 층을 제거하기에 적합한 반면, 미세 수술 블레이드 치밀골의 내부 층을 얇게 이상적이다. 개발하는 동안 두개골의 두께가 증가하고 강성으로, 성인 쥐의…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그래픽 제임스 Perna 감사합니다. 이 작품은 YZ에 정신 건강의 국립 연구소에서 교부금에 의해 지원되었다
Materials
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
References
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