Acute Brain Trauma in Muizen gevolgd door Longitudinale Twee-foton Imaging
Summary
Acuut hersenletsel is een ernstige verwonding die geen adequate behandeling tot op heden. Multifoton microscopie maakt het bestuderen van lengterichting van het proces van acuut hersenletsel ontwikkeling en indringende therapeutische strategieën bij knaagdieren. Twee modellen van acuut hersentrauma bestudeerd met in vivo twee-foton beeldvorming van de hersenen worden gedemonstreerd in dit protocol.
Abstract
Hoewel acuut hersenletsel vaak voort uit hoofd beschadiging verschillende ongevallen en een substantieel deel van de bevolking, is er geen effectieve behandeling voor is. Beperkingen van de momenteel gebruikte diermodellen belemmeren begrip van de pathologie mechanisme. Multifoton microscopie kan bestuderen cellen en weefsels in intacte hersenen van dieren langsrichting onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Hier beschrijven we twee modellen van acuut hersenletsel onderzocht door middel van twee-foton beeldvorming van de hersenen celgedrag onder posttraumatische omstandigheden. Een geselecteerd gebied van de hersenen wordt verwond met een scherpe naald om een trauma van een gecontroleerde breedte en diepte in de hersenen parenchym produceren. Onze methode maakt gebruik stereotaxisch prik met een injectienaald, die kunnen worden gecombineerd met gelijktijdige drug toepassing. We stellen dat deze methode kan worden gebruikt als een instrument om geavanceerde cellulaire mechanismen van pathofysiologische gevolgen van acuut traumatische bestuderen zoogdierhersenen <em> In vivo. In deze video, combineren we acuut hersenletsel met twee bereidingen: craniale venster en schedel dunner. We bespreken ook de voordelen en beperkingen van zowel de voorbereidingen voor multisessie beeldvorming van de hersenen regeneratie na een trauma.
Introduction
Acuut hersenletsel is een belangrijk probleem voor de volksgezondheid met een hoge incidentie van letsel bij auto-crashes, valt of aanvallen, en de hoge prevalentie van latere chronische handicap. Therapeutische benaderingen voor de behandeling van hersenbeschadiging blijven volledig symptomatisch, waardoor de doeltreffendheid van preklinische, chirurgische en intensive care beperken. Dit maakt de sociale en economische gevolgen van hersenletsel bijzonder ernstig. Om verschillende redenen, de meeste klinische onderzoeken kon verbeterd herstel na hersenletsel aangetoond middels nieuwe therapeutische benaderingen.
Diermodellen zijn cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor een fase waarin drugdoeltreffendheid kan worden voorspeld bij patiënten met hersenletsel. Op dit moment is een aantal gevestigde diermodellen van hoofdtrauma bestaan, inclusief gecontroleerde corticale invloed 1, vloeistof percussie letsel 2, dynamische corticale vervorming 3, gewicht-drop4 en foto verwondingen 5. Een aantal experimentele modellen werden gebruikt om bepaalde morfologische, moleculaire en gedragsmatige aspecten hoofd-trauma geassocieerde pathologie. Echter, geen enkel dier model is volledig in het valideren van nieuwe therapeutische strategieën. Ontwikkeling van betrouwbare, reproduceerbare en gecontroleerde diermodellen van hersenletsel moet de complexe pathologische processen van.
De nieuwe combinatie van de nieuwste microscopische beeldvorming technologieën en genetisch-gecodeerde fluorescerende reporters biedt een ongekende kans om alle fasen van hersenletsel, die de primaire letsel omvatten, het verspreiden van het primaire letsel, secundaire schade, en regeneratie onderzoeken. Vooral in vivo twee-foton microscopie is een unieke lineair optische technologie die real-time visualisatie van de cellulaire en subcellulaire structuren zelfs in diepe corticale lagen knaagdierhersenen maakt. Verschillende soorten cellen en orgaNelles tegelijkertijd worden afgebeeld door verschillende fluorescente merkers. Met behulp van deze krachtige tool, kunnen we dynamisch morfologische en functionele veranderingen te visualiseren in levende hersenen onder posttraumatische omstandigheden. De voordelen van in vivo twee-foton microscopie bestuderen hersenletsel werden onlangs aangetoond door Kirov en collega 6. Met behulp van een milde focale corticale kneuzing model, deze auteurs toonden aan dat acute dendritische verwonding in de pericontusional cortex is omheind door de daling van de lokale bloedstroom. Bovendien toonden zij aan dat het metabolisch gecompromitteerd cortex in de kneuzing terrein verder beschadigd door de verspreiding depolarisatie. Deze secundaire gevolgen heeft synaptische circuits, waardoor de gevolgen van traumatisch hersenletsel ernstiger.
Hier stellen we de methode van stereotaxisch prik met een injectienaald, die kunnen worden gecombineerd met gelijktijdige topische drug aanvraag, als een geavanceerd model voor lokale breinletsel en als een hulpmiddel om pathofysiologische gevolgen van acuut traumatische bestuderen hersenen van zoogdieren in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hersentrauma is een abrupt, onvoorspelbare gebeurtenis. Hier beschrijven we de diermodel dat een spectrum van pathologische veranderingen waargenomen bij menselijke patiënten na hersenletsel zoals neurodegeneratie, eliminatie van dendrieten, hersenoedeem, gliale litteken, bloedingen in de cerebrale cortex in combinatie met focale subarachnoïdale bloedingen en verhoogde permeabiliteit van de reproduceert bloed-hersenbarrière. Primaire en secundaire pathogenese, evenals herstel na trauma te bestuderen, werd dit letsel …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn diep dankbaar aan Dr Frank Kirchhoff voor het verstrekken van GFAP-EGFP en CX3CR1-EGFP muisspanningen. Het werk werd ondersteund door subsidies van het Centrum voor Internationale Mobiliteit van Finland, Tekes, Fins voor Neurowetenschappen (FGSN) en de Academie van Finland.
Materials
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30G ½’’ needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eyes-ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L. Experimental studies in head injury. Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
