Akutt Brain Trauma i Mus fulgt av Langsgående To-foton Imaging
Summary
Akutt traume hjernen er en alvorlig skade som ikke har noen adekvat behandling til dags dato. Multiphoton mikroskopi kan studere lengde prosessen med akutt hjernetraume utvikling og sondering terapeutiske strategier hos gnagere. To modeller av akutt hjernetraume studert med in vivo to-foton avbildning av hjernen er demonstrert i denne protokollen.
Abstract
Selv om det akutte hjernetraume resulterer ofte fra hodet skade på forskjellige ulykker og påvirker en betydelig del av befolkningen, er det ingen effektiv behandling for den ennå. Begrensninger av tiden brukes dyremodeller hindre forståelse av patologi mekanismen. Multiphoton mikroskopi kan studere celler og vev i intakte dyr hjernen lengde under fysiologiske og patologiske tilstander. Her beskriver vi to modeller av akutt hjerneskade studert ved hjelp av to-foton avbildning av hjernen celle oppførsel under posttraumatiske tilstander. En valgt hjerneregion blir skadet med en skarp nål for å produsere en traumer av en kontrollert bredde og dybde i hjernen parenchyma. Vår metode anvender stereotaktisk stikk med en kanyle, som kan kombineres med samtidig legemiddel søknad. Vi foreslår at denne fremgangsmåte kan anvendes som en avansert verktøy for å studere cellulære mekanismer av patofysiologiske følgene av akutt trauma i hjernen hos pattedyr <em> In vivo. I denne videoen, kombinerer vi akutt hjerneskade med to preparater: cranial vindu og skalle tynning. Vi har også diskutere fordeler og begrensninger av både forberedelsene til multisession avbildning av hjernen regenerasjon etter traumer.
Introduction
Akutt skade hjernen er et betydelig folkehelseproblem med høy forekomst av skader i motorkjøretøyer krasjer, faller eller overgrep, og høy forekomst av påfølgende kronisk funksjonshemming. Terapeutiske tilnærminger til behandling av hjerneskader forbli helt symptomatisk, og dermed begrense effektiviteten av prehospital, kirurgiske og kritisk behandling. Dette gjør de sosiale og økonomiske konsekvensene av hjerneskade spesielt alvorlig. For en rekke grunner, de fleste av de kliniske studiene viste ingen bedring i bedring etter hjerneskade ved hjelp av nye terapeutiske tilnærminger.
Dyremodeller er avgjørende for å utvikle nye terapeutiske strategier mot en scene der legemidlets effekt kan forutsies hos pasienter med hjerneskader. I dag er flere godt etablerte dyremodeller av hodetraume finnes, inkludert kontrollert kortikal virkning en, væskeperkusjonsskade 2, dynamisk kortikal deformasjon 3, vekt-slipp4 og fotoskade 5. En rekke eksperimentelle modeller har blitt brukt til å studere bestemte morfologiske, molekylære og atferdsmessige aspekter ved hodetraume-assosiert patologi. Det er imidlertid ingen enkel dyremodell helt vellykket i å validere nye terapeutiske strategier. Er nødvendig å vurdere de komplekse patologiske prosesser utvikling av pålitelige, reproduserbare og kontrollerte dyremodeller av hjerneskade.
Den nye kombinasjonen av de nyeste mikroskopiske bildeteknologi og genetisk kodet fluorescerende reportere gir en enestående mulighet til å undersøke alle faser av hjerneskade, som inkluderer primær skade, spredning av den primære skaden, sekundær skader, og regenerering. Spesielt er in vivo to-fotonmikros en unik ikke-lineær optisk teknologi som tillater sanntids visualisering av celle-og enda subcellulære strukturer i dype kortikale lag av gnager hjernen. Flere typer celler og organisaNelles kan avbildes samtidig ved å kombinere ulike fluorescerende markører. Ved hjelp av dette kraftige verktøyet, kan vi visualisere dynamiske morfologiske og funksjonelle endringer i levende hjernen etter posttraumatiske tilstander. Fordelene med in vivo to-foton mikroskopi i å studere hjerneskade ble nylig demonstrert av Kirov og kolleger seks. Ved hjelp av en mild fokal kortikal contusion modell, disse forfatterne viste at akutt dendrittiske skade i pericontusional cortex er inngjerdet av nedgangen i den lokale blodstrømmen. Videre har de vist at metabolisk kompromittert cortex rundt bloduttredelse side er ytterligere skadet av spredning depolarisering. Denne sekundære skader påvirker synaptiske krets, slik at konsekvensene av traumatisk hjerneskade mer alvorlig.
Her, foreslår vi å følge prosedyren i stereotaxic stikk med en kanyle, som kan bli kombinert med samtidig topisk medikament applikasjon, som en avansert modell for lokal hjerneskade og som et verktøy for å studere konsekvensene av patofysiologiske akutt trauma i hjernen hos pattedyr in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Brain traumer er en brå, uforutsigbar hendelse. Her beskriver vi en dyremodell som gjengir et spektrum av patologiske forandringer observert i humane pasienter etter hjerneskader slik som neurodegenerering, eliminering av dendritter, hjerneødem, glial arr, blødninger i den cerebrale cortex kombinert med fokal subarachnoid blødning og økt permeabilitet av blod-hjerne-barrieren. For å studere primær og sekundær patogenese, samt utvinning etter traume, ble denne skaden modellen kombinert med langsgående in viv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er dypt takknemlig til Dr. Frank Kirchhoff for å gi GFAP-EGFP og CX3CR1-EGFP musestammer. Arbeidet ble støttet med tilskudd fra Centre of International Mobility of Finland, Tekes, finsk Graduate School of Neuroscience (FGSN) og Academy of Finland.
Materials
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30G ½’’ needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eyes-ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L. Experimental studies in head injury. Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
