Stimulation der DNA-Sensing Zytoplasmatische Pathways<em> In-vitro-</em> Und<em> In Vivo</em
Summary
Das Ziel des Protokolls ist es, die optimalen Methoden zur Stimulierung der cytoplasmatischen DNA Erfassungswege in Zellen und in vivo zu verwenden. Dies wird durch die Verbesserung der Erzeugung von langen, doppelsträngigen DNA während blunt-end Ligation erreicht. Zellen oder Mäuse werden dann unter Verwendung einer Lipid Transfektionsreagenz transfiziert.
Abstract
Um effizient eine angeborene Immunantwort zu stimulieren, müssen DNA von ausreichender Länge und Reinheit sein. Wir stellen ein Verfahren, bei dem Doppelstrang-DNA (dsDNA), das die erforderlichen Eigenschaften hat, um die cytoplasmatischen DNA Erfassungswege kann kostengünstig und mit Leichtigkeit erzeugt werden stimulieren. Vom Concatemerisierungsreaktion von kurzen, synthetischen Oligonukleotiden (die CpG-Motive fehlen), können dsDNA erzeugt werden, um eine ausreichende Länge aufweisen, um die cytosolische DNA Erfassungspfad zu aktivieren. Dieses Protokoll beinhaltet Ligation stumpfer Enden der Oligonukleotide in Gegenwart von Polyethylenglykol (PEG), der eine Umgebung für effiziente Ligation statt bietet. Die dsDNA Concatemeren verwendet werden kann, nach der Reinigung durch Phenol / Chloroform-Extraktion, um die angeborene Immunantwort in vitro durch Standard Transfektionsprotokolle simulieren. Diese DNA kann auch verwendet werden, um angeborene Immunität in vivo durch intradermale Injektion in die Ohrmuschel der Maus zu stimulieren, zum Beispiel. DurchStandardisierung der Concatemerisierungsreaktion Prozess und die anschließende Stimulationsprotokolle kann eine zuverlässige und reproduzierbare Aktivierung des angeborenen Immunsystems produziert werden.
Introduction
DNA ist ein wichtiger Bestandteil aller Organismen und Zellen, die Eukaryoten halten in bestimmten Fächern. Eine Funktion des angeborenen Immunsystems ist es, festzustellen, wann solche Kompartimentierung bricht oder wenn Fremdkörper in den Organismus über eine Verletzung der körperlichen, externe Barrieren eingeführt. Im menschlichen Körper gibt es eine Reihe von Proteinen, zu helfen verschlechtern kleinen DNA-Mengen, die die korrekte Kompartimentierung entweichen kann existieren; DNAse I, II, und III brechen DNA im Plasma, Endosomen und Cytosol sind. Es hat sich jedoch gezeigt, dass Mäuse ohne DNAse II sterben an schweren Anämie, die durch übermäßige Produktion von Interferonen 1 was darauf hindeutet, dass verursacht das angeborene Immunsystem reagiert auf Extra-Kern-DNA. Diese Reaktion tritt auch in Mäusen, die in Toll-like-Rezeptor-Signal Kapazität völlig unzulänglich sind. Zahlreiche Studien haben jetzt, dass Stimulator der Interferon-Gene (STING) 2 und TANK-binding kinase 1 (TB gezeigtK1) 3 in der Detektion von DNA in das Cytoplasma und dass dieser Signalweg aktiviert, Interferon Regulatory Factor (IRF) -3 4 beteiligt. Die anschließende IRF3-abhängige Transkription von Zytokin-Chemokin-und Interferon-Gene ist charakteristisch für einen angeborenen Immunantwort, entweder einen Erreger oder Gefahr assoziierte molekulare Muster (PAMP oder DAMP) 5.
Der Wunsch, die intrazelluläre Signalwege Nucleinsäuredetektion Studie hat zu der Forderung geführt, um robuste und reproduzierbare Verfahren zur Stimulierung Zellen durch die Einführung von DNA oder RNA in Zellen ohne Aktivierung anderen angeborenen Immunantwort zu entwickeln. Eine Methode, durch die der Sting / TBK1 / IRF3 Wegs stimuliert werden kann durch Verwendung von kationischen Lipid-Transfektionsreagenzien Nukleinsäure in das Cytoplasma, wo sie von DNA-Sensoren, wie DNA-PK, IFI16 und CGAS 6-8 zugänglich zu liefern.
Die Eigenschaften der DNA, die derzeit verstanden werden eff ermöglicheniziente Aktivierung der cytoplasmatischen angeborenen Immunantwort ohne Stimulation anderer Wege sind die Länge, Masse, Reinheit und das Fehlen von CpG-Motiven 4,7,9. Synthetische Oligonukleotide eignen sich für die Zwecke der Erzeugung einer angeborenen Immunantwort, wie sie es dem DNA-Sequenz optimiert und als reine chemische Spezies hergestellt werden. Ein 45-Basenpaar-immunstimulatorischen DNA (ISD)-Sequenz wurde durch Stetson et al. 4 als geeignetes, CpG-freie Sequenz für diesen Zweck identifiziert. Diese dsDNA-Sequenz ist ansonsten zufällig und hat keine spezifischen Funktionen, die über ihren Mangel an CpG-Motive. Wir haben gefunden, daß durch concatemerizing ISD Oligonukleotids in deutlich längeren Stränge erhöht die Größe der Stimulations 7. Generation von concatemerized ISD ist daher nützlich für die Förderung einer zytoplasmatischen angeborenen Immunantwort. Hier präsentieren wir Protokolle zur Herstellung dieses Reagenz und wie sie verwendet werden, um die DNA Messweges de aktivierenvitro als auch in vivo.
HINWEIS: Alle Tierversuche genehmigt werden unter institutionellen Protokolle und Tierpflege-Richtlinien durchgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebenen Protokolle werden verwendet, um dsDNA zu erzeugen, um die cytosolische angeborenen Immunantwort mit reproduzierbaren Ergebnissen in einer Vielzahl von Zelltypen in vivo zu stimulieren. Da das Hauptsubstrat Reagenz verwendet wird, ist ein synthetisches Oligonukleotid, es ist die Flexibilität dieses Systems für die alternative DNA-Sequenzen oder chemische Modifikationen. Es ist möglich, zum Beispiel, um die in diesem Protokoll mit einem, der eine Fluoreszenzmarkierung oder ein Biotin-Ein…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren haben keine Bestätigungen.
Materials
| Forward Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA |
| Reverse Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TGTAGATCATGTACAGATCAGTCATAGATCACTAGTAGATCTGTA |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P-4463 | |
| Molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| T4 Polynucleotide Kinase | Promega | M4101 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | |
| Phenol:Chloroform | Fisher Chemical | BPE1752p-400 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C/4960/PB08 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| DNA gel loading buffer | New England biolabs | B7021S | |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Optimem | Life Technologies | 11058021 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bioscience | MIR 2300 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80901 Model 1705 | |
| 30G needles | BD bioscience | 304000 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | |
| Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Oligo(dT) primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | |
| Super Script III reverse transcriptase | Life Technologies | 56575 | |
| First strand cDNA synthesis buffer | Life Technologies | y02321 | |
| SybrGreen qPCR Fast master mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| cxcl10 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | ACTGCATCCATATCGATGAC |
| cxcl10 murine reverse primer | Integrated DNA technologies | n/a | TTCATCGTGGCAATGATCTC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
References
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