Recuperação cirúrgica, isolamento e<em> In vitro</em> Expansão de humanos anteriores Cruciate células do ligamento derivados para aplicações em engenharia de tecidos

Summary

Para aplicações futuras como um remendo para reparar ruptura parcial do ligamento cruzado anterior (LCA), LCA humano células derivadas foram isolados a partir de tecidos obtidos durante procedimentos reconstrutivos, expandidas in vitro e cultivados em engenharia de tecidos andaimes. Adesão celular e morfologia foi então realizada para confirmar a biocompatibilidade na superfície andaime.

Abstract

Prejuízo para o ACL é um problema comumente encontrado em indivíduos ativos. Mesmo lágrimas parciais deste intra-articular do ligamento do joelho levam a deficiências biomecânicas que prejudicam a função e estabilidade. As opções atuais para o tratamento das lesões do LCA parciais vão desde, o tratamento conservador não cirúrgico para várias opções cirúrgicas, tais como: modificação térmica, reparação de um único pacote, a reconstrução completa, ea reconstrução da parte danificada do ligamento nativo. Poucos estudos, se houver, têm demonstrado um método único para a gestão a ser consistentemente superior, e, em muitos casos, os pacientes continuam a demonstrar instabilidade persistente e outras co-morbidades.

O objetivo deste estudo é identificar a fonte de células potencial de utilização no desenvolvimento de um patch de engenharia de tecidos que podem ser implementadas na reparação de uma ACL parcialmente rasgada. Um novo protocolo foi desenvolvido para a expansão de células derivadas de patients submetidos a reconstrução do LCA. Para isolar as células, tecidos HACL picada obtida durante a reconstrução ACL foi digerido numa solução de colagenase. A expansão foi realizada utilizando um meio de DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). As células foram então armazenadas a -80 ° C ou em azoto líquido num meio de congelamento que consiste em DMSO, de FBS e o meio de expansão. Após descongelação, as células derivadas HACL foram então semeados em um andaime de engenharia de tecidos, PLAGA (ácido láctico-co-glicólico poli) e controlo de cultura de tecidos de poliestireno (TCPS). Após 7 dias, SEM foi realizada para comparar a adesão celular à PLAGA versus o controlo TCPS. Morfologia celular foi avaliada utilizando técnica de imunofluorescência. SEM (Scanning Electron Microscope) micrografias demonstraram que as células cresceram e respeitados em ambas as superfícies plaga e PFC e foram confluentes sobre as superfícies inteiras por dia 7. Imunofluorescência mostrou morfológico normal, não-estressadospadrões AL em ambas as superfícies. Esta técnica é promissora para aplicações em LCA regeneração e reconstrução.

Introduction

O ligamento cruzado anterior (LCA) é um ligamento intra-articular comumente lesionado do joelho. Aproximadamente 200.000 (LCA) são relatados anualmente nos Estados Unidos. Mais de 75% dos pacientes que sofreram lesão do LCA opt para a cirurgia reconstrutiva ortopédico ^1,2,3,4. A intervenção cirúrgica é muitas vezes indicada devido a um potencial de cura inerentemente pobre ^3. Reconstrução ACL é tipicamente conseguida por meio de um auto-enxerto ou enxerto de tendão. Autotransplante e enxerto representam o padrão ouro para a reconstrução, como eles possuem altas taxas de sucesso, e reparo sutura primária, a outra opção de tratamento, mostrou taxas de falha de até 94% ^5,6,7.

Ruptura parcial do ACL representam 10% a 28% de todas as lesões do LCA ^8. Em um estudo prospectivo, Noyes et al. Estima-se que 50% dos pacientes com lesões parciais que afetam mais da metade da ACL progrediu para completar ACL insuficiência depois nãotratamento cirúrgico ^9. Outros estudos relatam instabilidade persistente e diminuição da função com menos de 30% dos pacientes capazes de retornar à sua pré-lesão nível de atividade ^{9,10,11,12,13.} As opções de tratamento são limitadas e incluem modalidades conservadoras, encolhimento térmico do restante ACL, ou a reconstrução do LCA. Recentemente, tem havido um interesse crescente em reparo primário aumentada. Estas técnicas utilizam produtos biológicos para melhorar reparos sutura primária ^14. Uma pesquisa recente tentou colher mesenquimais semelhantes HACL derivados de células-tronco para contornar as limitações do enxerto, ^31,32 mas a validade e eficácia destas células ainda é desconhecido. A fonte ideal de células para aplicações de engenharia de tecidos parece ser não-mesechymal HACL derivadas de células de fibroblastos.

A pesquisa atual está focada na identificação de um material de matriz adequada e fonte de células para o cadafalso engenharia. É procedimento padrão para um ACL rasgado para ser descartado como suresíduos rgical durante a cirurgia de reconstrução, no entanto, este ligamento danificado pode ser uma fonte de qualidade para a aquisição de células necessárias para desenvolver e melhorar um tecido ideal projetado substituição ACL. Nosso laboratório desenvolveu um protocolo para a expansão in vitro de células derivadas destas HACL colhidas. Usando uma matriz 2D engenharia infundido com células derivadas HACL, criamos um patch que pode potencialmente aumentar o reparo ACL parcial e fortalecer ligamentos rompidos.

Protocol

1. Recuperação Cirúrgica Nota: Uma aprovação IRB foi obtida para coletar o coto do LCA durante a cirurgia de reconstrução do LCA. Isenção IRB foi dado como o coto ACL usado geralmente eram descartados como lixo cirúrgico. 20 pacientes foram usados ​​para coletar o coto do LCA. Administrar anestesia geral e antibióticos pre-operatórios, conforme o protocolo da instituição para o paciente. Aplicar torniquete e inflar 100 mg acima da pressão arterial sist…

Representative Results

O modelo de trabalho para recuperação cirúrgica, a digestão do tecido e isolamento do ser humano Ligamento Cruzado Anterior (HACL) células derivadas é mostrado na Figura 1. As células migraram de explantes e aderiu à T-25 frascos. Estas células foram cultivadas durante 3 dias e, em seguida, foram visualizados sob um microscópio de luz (Figura 2). Uma monocamada confluente foi obtido no dia 7. A presença de células viáveis, saudáveis ​​indicou a recuperação bem sucedi…

Discussion

O objetivo principal deste estudo andaime hACL/2D era usar as células obtidas em um patch para aumentar o reparo primário de lágrimas ACL parciais. Tratamento não-cirúrgico de lesões do LCA parciais podem incluir um curto período de imobilização, órtese, um programa de reabilitação progressiva, e as avaliações de acompanhamento regulares ^13,16,17. No entanto, muitos estudos mostraram que o tratamento conservador em atletas tem sido associado com resultados pobres e falha. Buckley et al.…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Petri-dish	Fisher Scientific	08-757-103C
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994
Collagenase	Gibco	17018-029	Store at 40C
DMEM/F-12	Cellgro	10-092-CV	Store at 40C. Warm in 370C water bath before use.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10082	Store at -800C
Penicillin/Streptomycin	Lonza	17-602E	Store at 40C
Centrifuge Tubes- 15 ml	Corning	430790
T-25 flasks	BD Falcon	3013
Trypsin-Versene mixture	Lonza	17-161E	Store at 40C. Warm in 370C water bath before use.
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100	Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation.
Cryogenic vials	Corning	430489
PLAGA	Purac Biomaterials	Purasorb PLG8523	Store at -800C
TCPS disks	Fisher Scientific	12-545-82
Dichloromethane	Fisher Scientific	AC36423-0010	Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place.
Bytac paper	Saint gobin performance plastics	1420652
Scintillation vial	Fisher Scientific	03-339-21G
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906	Store at 40C
Tween	Fisher Scientific	BP337-500
mouse Anti-β-actin antibody (10 Ab)	Sigma Aldrich	A5441	Store at -200C
goat-anti-mouse antibody (20 Ab)	Cell Signaling	4408	Store at -200C
Hoechst dye	Sigma Aldrich	14530	Store at -200C
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glutaraldehyde	Fisher Scientific	BP2547-1	Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes.
Hexamethyldisilazane	Fisher Scientific	AC43085-1000	Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes.
Sterile Scissors	McKesson	25-716
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Light Microscope	Olympus	CK40
Water Bath	Thermo scientific	2845
Vortex	Labnet	VX-200
Glass Petri plates	fisher Scientific	S31473
Acu-Punch	Acuderm Inc.	P1225	Acu-Punch was used to cut 12mm disks
Cacodylate buffer	Sigma Aldrich	97068	Flammable liquid, carcinogen and irritant.
Osmium tetraoxide	Sigma Aldrich	201030	Highly toxic
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	Harmful if swallowed
Ethanol	Decon Labs	2705	Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition.
General/regional Anesthesia	Amphastar pharmaceuticals		1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance
Antibiotics	Hospira	0409-0805-01	Ancef 1g i.v.
Arthroscopy trocar	Smith and Nephew
Arthroscopy Camera	Smith and Nephew
Arthroscopic grasper and bitter	Arthrex
4.5mm shaver	Arthrex
Interference Screws	Arthrex		stainless steel screws
Sputter Coater	Polaron	E5400