Para aplicações futuras como um remendo para reparar ruptura parcial do ligamento cruzado anterior (LCA), LCA humano células derivadas foram isolados a partir de tecidos obtidos durante procedimentos reconstrutivos, expandidas in vitro e cultivados em engenharia de tecidos andaimes. Adesão celular e morfologia foi então realizada para confirmar a biocompatibilidade na superfície andaime.
Prejuízo para o ACL é um problema comumente encontrado em indivíduos ativos. Mesmo lágrimas parciais deste intra-articular do ligamento do joelho levam a deficiências biomecânicas que prejudicam a função e estabilidade. As opções atuais para o tratamento das lesões do LCA parciais vão desde, o tratamento conservador não cirúrgico para várias opções cirúrgicas, tais como: modificação térmica, reparação de um único pacote, a reconstrução completa, ea reconstrução da parte danificada do ligamento nativo. Poucos estudos, se houver, têm demonstrado um método único para a gestão a ser consistentemente superior, e, em muitos casos, os pacientes continuam a demonstrar instabilidade persistente e outras co-morbidades.
O objetivo deste estudo é identificar a fonte de células potencial de utilização no desenvolvimento de um patch de engenharia de tecidos que podem ser implementadas na reparação de uma ACL parcialmente rasgada. Um novo protocolo foi desenvolvido para a expansão de células derivadas de patients submetidos a reconstrução do LCA. Para isolar as células, tecidos HACL picada obtida durante a reconstrução ACL foi digerido numa solução de colagenase. A expansão foi realizada utilizando um meio de DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). As células foram então armazenadas a -80 ° C ou em azoto líquido num meio de congelamento que consiste em DMSO, de FBS e o meio de expansão. Após descongelação, as células derivadas HACL foram então semeados em um andaime de engenharia de tecidos, PLAGA (ácido láctico-co-glicólico poli) e controlo de cultura de tecidos de poliestireno (TCPS). Após 7 dias, SEM foi realizada para comparar a adesão celular à PLAGA versus o controlo TCPS. Morfologia celular foi avaliada utilizando técnica de imunofluorescência. SEM (Scanning Electron Microscope) micrografias demonstraram que as células cresceram e respeitados em ambas as superfícies plaga e PFC e foram confluentes sobre as superfícies inteiras por dia 7. Imunofluorescência mostrou morfológico normal, não-estressadospadrões AL em ambas as superfícies. Esta técnica é promissora para aplicações em LCA regeneração e reconstrução.
O ligamento cruzado anterior (LCA) é um ligamento intra-articular comumente lesionado do joelho. Aproximadamente 200.000 (LCA) são relatados anualmente nos Estados Unidos. Mais de 75% dos pacientes que sofreram lesão do LCA opt para a cirurgia reconstrutiva ortopédico 1,2,3,4. A intervenção cirúrgica é muitas vezes indicada devido a um potencial de cura inerentemente pobre 3. Reconstrução ACL é tipicamente conseguida por meio de um auto-enxerto ou enxerto de tendão. Autotransplante e enxerto representam o padrão ouro para a reconstrução, como eles possuem altas taxas de sucesso, e reparo sutura primária, a outra opção de tratamento, mostrou taxas de falha de até 94% 5,6,7.
Ruptura parcial do ACL representam 10% a 28% de todas as lesões do LCA 8. Em um estudo prospectivo, Noyes et al. Estima-se que 50% dos pacientes com lesões parciais que afetam mais da metade da ACL progrediu para completar ACL insuficiência depois nãotratamento cirúrgico 9. Outros estudos relatam instabilidade persistente e diminuição da função com menos de 30% dos pacientes capazes de retornar à sua pré-lesão nível de atividade 9,10,11,12,13. As opções de tratamento são limitadas e incluem modalidades conservadoras, encolhimento térmico do restante ACL, ou a reconstrução do LCA. Recentemente, tem havido um interesse crescente em reparo primário aumentada. Estas técnicas utilizam produtos biológicos para melhorar reparos sutura primária 14. Uma pesquisa recente tentou colher mesenquimais semelhantes HACL derivados de células-tronco para contornar as limitações do enxerto, 31,32 mas a validade e eficácia destas células ainda é desconhecido. A fonte ideal de células para aplicações de engenharia de tecidos parece ser não-mesechymal HACL derivadas de células de fibroblastos.
A pesquisa atual está focada na identificação de um material de matriz adequada e fonte de células para o cadafalso engenharia. É procedimento padrão para um ACL rasgado para ser descartado como suresíduos rgical durante a cirurgia de reconstrução, no entanto, este ligamento danificado pode ser uma fonte de qualidade para a aquisição de células necessárias para desenvolver e melhorar um tecido ideal projetado substituição ACL. Nosso laboratório desenvolveu um protocolo para a expansão in vitro de células derivadas destas HACL colhidas. Usando uma matriz 2D engenharia infundido com células derivadas HACL, criamos um patch que pode potencialmente aumentar o reparo ACL parcial e fortalecer ligamentos rompidos.
O objetivo principal deste estudo andaime hACL/2D era usar as células obtidas em um patch para aumentar o reparo primário de lágrimas ACL parciais. Tratamento não-cirúrgico de lesões do LCA parciais podem incluir um curto período de imobilização, órtese, um programa de reabilitação progressiva, e as avaliações de acompanhamento regulares 13,16,17. No entanto, muitos estudos mostraram que o tratamento conservador em atletas tem sido associado com resultados pobres e falha. Buckley et al.…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer do fundo e departamento de cirurgia bolsa de pesquisa da Southern Illinois University, School of Medicine start-up; ea concessão Memorial Medical Foundation.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Petri-dish | Fisher Scientific | 08-757-103C | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
Collagenase | Gibco | 17018-029 | Store at 40C |
DMEM/F-12 | Cellgro | 10-092-CV | Store at 40C. Warm in 370C water bath before use. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082 | Store at -800C |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | Store at 40C |
Centrifuge Tubes- 15 ml | Corning | 430790 | |
T-25 flasks | BD Falcon | 3013 | |
Trypsin-Versene mixture | Lonza | 17-161E | Store at 40C. Warm in 370C water bath before use. |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation. |
Cryogenic vials | Corning | 430489 | |
PLAGA | Purac Biomaterials | Purasorb PLG8523 | Store at -800C |
TCPS disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
Dichloromethane | Fisher Scientific | AC36423-0010 | Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place. |
Bytac paper | Saint gobin performance plastics | 1420652 | |
Scintillation vial | Fisher Scientific | 03-339-21G | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Store at 40C |
Tween | Fisher Scientific | BP337-500 | |
mouse Anti-β-actin antibody (10 Ab) | Sigma Aldrich | A5441 | Store at -200C |
goat-anti-mouse antibody (20 Ab) | Cell Signaling | 4408 | Store at -200C |
Hoechst dye | Sigma Aldrich | 14530 | Store at -200C |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Glutaraldehyde | Fisher Scientific | BP2547-1 | Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes. |
Hexamethyldisilazane | Fisher Scientific | AC43085-1000 | Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes. |
Sterile Scissors | McKesson | 25-716 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
Light Microscope | Olympus | CK40 | |
Water Bath | Thermo scientific | 2845 | |
Vortex | Labnet | VX-200 | |
Glass Petri plates | fisher Scientific | S31473 | |
Acu-Punch | Acuderm Inc. | P1225 | Acu-Punch was used to cut 12mm disks |
Cacodylate buffer | Sigma Aldrich | 97068 | Flammable liquid, carcinogen and irritant. |
Osmium tetraoxide | Sigma Aldrich | 201030 | Highly toxic |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | Harmful if swallowed |
Ethanol | Decon Labs | 2705 | Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition. |
General/regional Anesthesia | Amphastar pharmaceuticals | 1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance | |
Antibiotics | Hospira | 0409-0805-01 | Ancef 1g i.v. |
Arthroscopy trocar | Smith and Nephew | ||
Arthroscopy Camera | Smith and Nephew | ||
Arthroscopic grasper and bitter | Arthrex | ||
4.5mm shaver | Arthrex | ||
Interference Screws | Arthrex | stainless steel screws | |
Sputter Coater | Polaron | E5400 |