Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration

Résumé

Procédé pour l'isolement rapide de mitochondries à partir de biopsies de tissu de mammifère est décrite. foie de rat ou des préparations musculaires squelettiques ont été homogénéisés avec un dissociateur tissu commercial et les mitochondries ont été isolées par filtration différentielle à travers des filtres en filet de nylon. Temps d'isolement des mitochondries est <30 min par rapport à 60 - 100 min en utilisant des méthodes alternatives.

Résumé

Méthodes d'isolement des mitochondries décrites précédemment par centrifugation différentielle et / ou gradient de Ficoll centrifugation nécessitent 60 à 100 min pour terminer. Nous décrivons un procédé pour l'isolement rapide de mitochondries à partir de biopsies de mammifère en utilisant un dissociateur tissulaire commercial et filtration différentielle. Dans ce protocole, l'homogénéisation manuel est remplacé par un cycle d'homogénéisation normalisée du dissociateur tissulaire. Cela permet d'homogénéisation uniforme et cohérente de tissu qui n'est pas facile à réaliser avec homogénéisation manuelle. Après dissociation des tissus, le broyat est filtré à travers des filtres de maille de nylon, ce qui élimine les étapes de centrifugation répétitives. En conséquence, l'isolement des mitochondries peut être effectuée en moins de 30 min. Ce protocole d'isolement rendement d'environ 2 x 10 ¹⁰ mitochondries compétentes viables et la respiration de 0,18 ± 0,04 g (poids humide) de l'échantillon de tissu.

Introduction

Les mitochondries existent dans toutes les cellules du corps à l'exception des globules rouges et sont impliqués dans un grand nombre de processus cellulaires et métaboliques importantes ^1-4. En raison de ces nombreuses fonctions, dommage mitochondrial peut avoir des effets néfastes ^3. Afin d'étudier la fonction mitochondriale et la dysfonction plusieurs méthodes d'isolement des mitochondries ont été décrits. Les premiers comptes publiés de mitochondrial date de l'isolement à la 1940 ^5-8. Le premier essai a démontré documenté isolement des mitochondries par broyage du tissu hépatique dans un mortier puis par centrifuga....

Protocole

Préparation

1. Préparez 1 M K-HEPES Stock Solution (ajuster le pH à 7,2 avec KOH).
2. Préparer M K-EGTA Stock Solution (ajuster le pH à 8,0 avec KOH) 0,5.
3. Préparez 1 M KH ₂ PO ₄ Stock Solution.
4. Préparez 1 M _MgCl2 Solution mère.
5. Préparation du tampon d'homogénéisation (pH 7,2), 300 mM de saccharose, 10 mM de HEPES-K, et 1 mM d'EGTA-K. Conserver à 4 ° C.
6. Préparer le tampon de respiration 250 mM de saccharose, 2 mM de KH ₂ PO _4, 10 mM MgCl _2, mM de tampon HEPES-K 20 (pH 7,2) et 0,5 mM de K-EGTA (pH 8,0). Conserver à 4 ° C.
7. Préparer l....

Résultats

A la figure décrivant les étapes de la procédure dans l'isolement des mitochondries des tissus à l'aide de dissociation et de filtration différentielle est représentée sur la Figure 1. Temps de procédure total est inférieur à 30 min.

Des échantillons de tissus ont été obtenus en utilisant un poinçon de biopsie de 6 mm. poids des tissus a été de 0,18 ± 0,04 g (poids humide). Le nombre des mitochondries isolées tel que déterminé par la taille des particules de comptage.......

Discussion

Pour isoler avec succès mitochondries qui utilisent ce protocole, il est essentiel de garder toutes les solutions et les échantillons de tissus sur la glace pour conserver la viabilité mitochondriale. Même lorsqu'il est maintenu sur la glace, les mitochondries isolées présenteront une diminution de l'activité fonctionnelle au fil du temps ^19. Nous recommandons que toutes les solutions et les ajouts être pré-préparés. Nous avons pré-peser et stocker subtilisine A à 4 mg aliquotes de 1,5 ml microtubes e.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sucrose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite Système de dosage de luminescence, 1,000 Kit de dosage	Perkin Elmer
50 ml Tubes Coniques	BD	352098
40 &mu ; m Filtres en nylon	BD  ;	352340
GentleMACS C tube	Miltenyl Biotech	120-005-331
1,5 ml tube Eppendorf	Fisher Scientific	05-408-129
Poinçon de biopsie 6 mm	Miltex	33-36
10 &mu ; m Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C  ;
Dissociateur GentleMACS  ;	Miltenyl Biotech	130-093-235
Plaques à 96 puits, traitement par culture tissulaire	VWR	82050-732
Agitateur orbital Rotomax 120	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Lecteur de microplaques	BioTek
Multisizer 4 Compteur	Beckman Coulter	A63076
Système Oxytherm	Hansatech Instruments
Hémacytomètre	Fisher Scientific	267110

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