בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון
Summary
שיטה לבידוד מהיר של המיטוכונדריה מביופסיות רקמות יונקים מתוארת. כבד חולדה או תכשירי שרירי שלד היה הומוגני עם Dissociator רקמה מסחרי ומיטוכונדריה היו מבודדת על ידי סינון ההפרש דרך מסנני רשת ניילון. זמן בידוד מיטוכונדריאלי הוא <30 דקות בהשוואה ל60-100 דקות תוך שימוש בשיטות אלטרנטיביות.
Abstract
שיטות בידוד המיטוכונדריה שתוארו קודם לכן באמצעות צנטריפוגה ההפרש ו / או צנטריפוגה שיפוע Ficoll דורשות 60 עד 100 דקות כדי להשלים. אנו מתארים שיטה לבידוד המהיר של המיטוכונדריה מביופסיות של יונקים באמצעות Dissociator רקמה מסחרי וסינון ההפרש. בפרוטוקול זה, הומוגניזציה ידנית הוחלפה במחזור הומוגניזציה הסטנדרטי של Dissociator הרקמה. זה מאפשר למדים ולתפעול עקבי של רקמה שאינה מושגת בקלות עם הומוגניזציה ידנית. בעקבות ניתוק רקמות, homogenate מסונן דרך מסנני רשת ניילון, אשר מבטלים צעדי צנטריפוגה חוזר על עצמו. כתוצאה מכך, בידוד המיטוכונדריה יכול להתבצע בפחות מ 30 דקות. פרוטוקול בידוד זה תשואה של כ 2 x 10 10 מיטוכונדריה מוסמכת קיימא ונשימה מ0.18 ± 0.04 גרם דגימת רקמה (משקל רטובה).
Introduction
מיטוכונדריה קיימת בכל תא ותא בגוף מלבד תאי דם אדומים ומעורבים במספר רב של תהליכים תאיים וחילוף חומרים חשובים 1-4. בגלל פונקציות רבות אלה, נזק המיטוכונדריה יכול להיות השפעות מזיקות 3. על מנת לחקור מספר שיטות בידוד המיטוכונדריה פונקציה ותפקוד הלקוי של המיטוכונדריה תוארו. החשבונות הראשונים שפורסמו ממועד בידוד המיטוכונדריה ל1940s 5-8. הניסיון המתועד הראשון הפגין בידוד המיטוכונדריה על ידי שחיקה רקמת כבד במכתש ואחריו צנטריפוגה בתמיסת מלח במהירות נמוכה 5,8. מאוחר יותר, קבוצות אחרות הרחיבו בעניין ההליך המקורי והפגינו חלוקה רקמות מבוססת על צנטריפוגה ההפרש 6-8. שיטות המוקדמות אלה היוו את הבסיס לטכניקות הנוכחיות אשר לעתים קרובות לשלב הומוגניזציה, ו / או צנטריפוגה ההפרש 9-15. מספר homogenizatiובצנטריפוגה צעדים משתנה בין פרוטוקולים. צעדים חוזרים ונשנים אלה להגדיל את הזמן לבידוד המיטוכונדריה וסופו של דבר להפחית את הכדאיות. בנוסף, הומוגניזציה ידנית יכולה לגרום לתוצאות נזק ועולה בקנה אחד המיטוכונדריה אם לא מבוקרת 10,16 כראוי.
לאחרונה, השתמשנו צנטריפוגה הומוגניזציה וההפרש לבודד את המיטוכונדריה להשתלה לרקמת שריר לב 17,18. הליך בידוד ממושך זה נדרש כ 90 דקות והיישום הקליני של שיטה זו היה אפוא מוגבל. כדי לאפשר שימוש טיפולי אקוטי בטיפול קליני וכירורגים שפיתחנו הליך בידוד המיטוכונדריה מהיר שניתן לבצע בפחות מ 30 דקות.
היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם כי ניתוק רקמה סטנדרטי מאפשר למדים ולתפעול עקבי של רקמה שאינה מושגת בקלות עם הומוגניזציה ידנית. בadditיון, השימוש בסינון ההפרש במקום של צנטריפוגה ההפרש מבטל זמן רב וצעדי צנטריפוגה חוזר על עצמו ומאפשרים לבידוד מהיר יותר של מיטוכונדריה המוסמכת נקיה במיוחד, בת קיימא ונשימה.
היכולת לבודד מיטוכונדריה המוסמכת קיימא ונשימה בפחות מ 30 דקות מאפשרת ליישום קליני. יש פרוטוקול בידוד זה פוטנציאל לשימוש בניתוח מעקפי השתלה (CABG) ונהלים טיפוליים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לבודד בהצלחה מיטוכונדריה תוך שימוש בפרוטוקול זה הוא חיוני כדי לשמור על כל הפתרונות ודגימות רקמה על קרח כדי לשמור על יכולת קיום של המיטוכונדריה. גם כאשר שמר על קרח, מיטוכונדריה המבודדת תפגין ירידה בפעילות תפקודית לאורך זמן 19. אנו ממליצים שכל הפתרונות והתוספ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי לאומי ללב, ריאות ודם מכון גרנט HL- 103,542, וTrailblazer פרס נכבד BCH הרדמת המחקר של הקרן לCAP.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84100 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Substilsin A | Sigma Aldrich | P5380 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit |
Perkin Elmer | 6016941 | |
| Equipment | |||
| 50 mL Conical Tubes | BD | 352098 | |
| 40 μm Nylon Filters | BD | 352340 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 mm biopsy punch | Miltex | 33-36 | |
| 10 μm Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| 96-well plates, tissue culture treated | VWR | 82050-732 | |
| Rotomax 120 orbital shaker | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader |
BioTek | ||
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
| Oxytherm System | Hansatech Instruments | ||
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
References
- van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
- Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317 (2011).
- Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
- Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
- Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
- Ernster, L., Schtaz, G. Mitochondria: a historical Review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
- Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
- McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
- Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
- Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
