Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration
Summary
Procédé pour l'isolement rapide de mitochondries à partir de biopsies de tissu de mammifère est décrite. foie de rat ou des préparations musculaires squelettiques ont été homogénéisés avec un dissociateur tissu commercial et les mitochondries ont été isolées par filtration différentielle à travers des filtres en filet de nylon. Temps d'isolement des mitochondries est <30 min par rapport à 60 – 100 min en utilisant des méthodes alternatives.
Abstract
Méthodes d'isolement des mitochondries décrites précédemment par centrifugation différentielle et / ou gradient de Ficoll centrifugation nécessitent 60 à 100 min pour terminer. Nous décrivons un procédé pour l'isolement rapide de mitochondries à partir de biopsies de mammifère en utilisant un dissociateur tissulaire commercial et filtration différentielle. Dans ce protocole, l'homogénéisation manuel est remplacé par un cycle d'homogénéisation normalisée du dissociateur tissulaire. Cela permet d'homogénéisation uniforme et cohérente de tissu qui n'est pas facile à réaliser avec homogénéisation manuelle. Après dissociation des tissus, le broyat est filtré à travers des filtres de maille de nylon, ce qui élimine les étapes de centrifugation répétitives. En conséquence, l'isolement des mitochondries peut être effectuée en moins de 30 min. Ce protocole d'isolement rendement d'environ 2 x 10 10 mitochondries compétentes viables et la respiration de 0,18 ± 0,04 g (poids humide) de l'échantillon de tissu.
Introduction
Les mitochondries existent dans toutes les cellules du corps à l'exception des globules rouges et sont impliqués dans un grand nombre de processus cellulaires et métaboliques importantes 1-4. En raison de ces nombreuses fonctions, dommage mitochondrial peut avoir des effets néfastes 3. Afin d'étudier la fonction mitochondriale et la dysfonction plusieurs méthodes d'isolement des mitochondries ont été décrits. Les premiers comptes publiés de mitochondrial date de l'isolement à la 1940 5-8. Le premier essai a démontré documenté isolement des mitochondries par broyage du tissu hépatique dans un mortier puis par centrifugation dans une solution de sel à faible vitesse 5,8. Plus tard, d'autres groupes étendus sur la procédure d'origine et ont démontré fractionnement du tissu sur la base de la centrifugation différentielle 8.6. Ces premières méthodes ont constitué la base des techniques actuelles qui intègrent souvent homogénéisation et / ou centrifugation différentielle 9-15. Le nombre de homogenizatiet les étapes de centrifugation varie selon les protocoles. Ces étapes répétitives d'augmenter le temps pour l'isolement des mitochondries et finalement réduisent la viabilité. En outre, l'homogénéisation manuel peut provoquer des dommages et incohérentes mitochondriales résultats s'il n'est pas correctement contrôlée 10,16.
Récemment, nous avons utilisé l'homogénéisation et centrifugation différentielle pour isoler les mitochondries pour la transplantation dans le tissu myocardique 17,18. Cette procédure d'isolement longue besoin d'environ 90 minutes et l'applicabilité clinique de cette méthode est donc limitée. Pour permettre une utilisation thérapeutique dans le traitement aigu et clinique chirurgicale nous avons mis au point un procédé d'isolement des mitochondries rapide qui peut être effectué en moins de 30 min.
Les principaux avantages de ce protocole sont que la dissociation des tissus uniformisée permet d'uniforme et cohérente homogénéisation du tissu qui n'est pas facile à réaliser avec homogénéisation manuel. Dans suppion, l'utilisation de la filtration différentielle à la place de la centrifugation différentielle élimine beaucoup de temps et répétition des étapes de centrifugation permettant l'isolement des mitochondries plus rapide compétentes hautement purifiés, viables et de respiration.
La capacité à isoler les mitochondries compétentes viables et de respiration en moins de 30 minutes permet d'applicabilité clinique. Ce protocole d'isolement a un potentiel pour une utilisation en chirurgie coronaire pontage aorto-greffe (CABG), et d'autres procédures thérapeutiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour isoler avec succès mitochondries qui utilisent ce protocole, il est essentiel de garder toutes les solutions et les échantillons de tissus sur la glace pour conserver la viabilité mitochondriale. Même lorsqu'il est maintenu sur la glace, les mitochondries isolées présenteront une diminution de l'activité fonctionnelle au fil du temps 19. Nous recommandons que toutes les solutions et les ajouts être pré-préparés. Nous avons pré-peser et stocker subtilisine A à 4 mg aliquotes de 1,5 ml…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL-103542, et le Prix Trailblazer émérite de la Fondation de recherche en anesthésie BCH à la PAC.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84100 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Substilsin A | Sigma Aldrich | P5380 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit |
Perkin Elmer | 6016941 | |
| Equipment | |||
| 50 mL Conical Tubes | BD | 352098 | |
| 40 μm Nylon Filters | BD | 352340 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 mm biopsy punch | Miltex | 33-36 | |
| 10 μm Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| 96-well plates, tissue culture treated | VWR | 82050-732 | |
| Rotomax 120 orbital shaker | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader |
BioTek | ||
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
| Oxytherm System | Hansatech Instruments | ||
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
References
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