Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale

Summary

Un metodo rapido isolamento dei mitocondri da biopsie di tessuto mammiferi è descritto. Fegato di ratto o preparazioni muscolari scheletriche sono stati omogeneizzati con un dissociatore tessuto commerciale e mitocondri sono stati isolati per filtrazione differenziale attraverso filtri a rete di nylon. Tempo di isolamento mitocondriale è <30 min rispetto ai 60 – 100 min con metodi alternativi.

Abstract

Metodi di isolamento mitocondriali precedentemente descritti utilizzando centrifugazione differenziale e / o Ficoll gradiente di centrifugazione richiedono da 60 a 100 minuti per completare. Noi descriviamo un metodo per il rapido isolamento di mitocondri da biopsie di mammifero usando un dissociatore tessuto commerciale e filtrazione differenziale. In questo protocollo, omogeneizzazione manuale viene sostituito con il ciclo omogeneizzazione standardizzata del dissociatore tessuti. Questo permette uniforme e costante omogeneizzazione del tessuto che non è facilmente ottenibile con omogeneizzazione manuale. A seguito di dissociazione dei tessuti, l'omogeneizzato è filtrata attraverso filtri a rete di nylon, che eliminano le fasi di centrifugazione ripetitivi. Come risultato, l'isolamento mitocondriale può essere eseguito in meno di 30 min. Questo protocollo isolamento produce circa 2 x 10 ¹⁰ mitocondri competenti vitali e la respirazione da 0,18 ± 0,04 g di campione di tessuto (peso a umido).

Introduction

Esistono mitocondri in ogni cellula del corpo ad eccezione dei globuli rossi e sono coinvolti in un gran numero di importanti processi cellulari e metabolici ^1-4. A causa di queste numerose funzioni, danno mitocondriale può avere effetti negativi ^3. Al fine di indagare la funzione mitocondriale e disfunzione diversi metodi di isolamento mitocondriali sono state descritte. I primi resoconti pubblicati su mitocondriale data isolamento al 1940 ^5-8. Il primo tentativo documentato dimostrato isolamento mitocondriale dalla macinazione di tessuto epatico in un mortaio seguita da centrifugazione in una soluzione salina a bassa velocità ^5,8. Più tardi, altri gruppi estesa, la procedura originale e dimostrato frazionamento del tessuto sulla base di centrifugazione differenziale di ^6-8. Questi primi metodi hanno costituito la base delle tecniche attuali, che spesso incorporano omogeneizzazione, e / o differenziale centrifugazione ^9-15. Il numero di homogenizatisu e centrifugazione gradini varia tra i protocolli. Questi passaggi ripetitivi aumentano il tempo per l'isolamento dei mitocondri e, infine, ridurre la vitalità. Inoltre, omogeneizzazione manuale può causare danni e inconsistenti risultati mitocondriali se non adeguatamente controllato ^10,16.

Recentemente, abbiamo utilizzato omogeneizzazione e centrifugazione differenziale per isolare i mitocondri per trapianto nel tessuto miocardico ^17,18. Questa procedura di isolamento lunga tenuta di circa 90 minuti e l'applicabilità clinica di questo metodo era quindi limitata. Per consentire l'uso terapeutico acuto nel trattamento clinico e chirurgico abbiamo sviluppato una rapida procedura di isolamento mitocondriale che può essere eseguito in meno di 30 min.

I principali vantaggi di questo protocollo è che la dissociazione del tessuto standardizzata consente di uniforme e coerente omogeneizzazione del tessuto che non è facilmente ottenibile con omogeneizzazione manuale. In Additione, l'uso di filtrazione differenziale al posto di centrifugazione differenziale elimina richiede tempo e le fasi di centrifugazione ripetitive consentendo un più rapido isolamento di altamente purificati, vitali e respirazione mitocondri competenti.

La capacità di isolare mitocondri competenti vitali e respirazione in meno di 30 minuti permette di applicabilità clinica. Questo protocollo di isolamento ha il potenziale per l'uso in chirurgia di bypass coronarico (CABG) e altre procedure terapeutiche.

Protocol

Preparazione Preparare 1 M K-HEPES Stock Solution (aggiustare il pH a 7,2 con KOH). Preparare 0,5 M K-EGTA Stock Solution (aggiustare il pH a 8,0 con KOH). Preparare 1 M KH 2 PO 4 Stock Solution. Preparare 1 M MgCl 2 Stock Solution. Preparare omogeneizzazione Buffer (pH 7,2) saccarosio 300 mM, 10 mM K-HEPES, e 1 mM K-EGTA. Conservare a 4 ° C. Preparare saccarosio respirazione Buffer 250 mm, 2 mm KH 2 PO 4,</sub…

Representative Results

Una figura che illustra le fasi procedurali nel isolamento dei mitocondri mediante dissociazione dei tessuti e la filtrazione differenziale è mostrato in Figura 1. Tempo procedurale totale è inferiore a 30 min. I campioni di tessuto sono stati ottenuti utilizzando una biopsia 6 mm. Peso del tessuto era 0,18 ± 0,04 g (peso umido). Il numero dei mitocondri isolati come determinato mediante conteggio granulometria era 2,4 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitocond…

Discussion

Per isolare con successo mitocondri utilizzano questo protocollo è essenziale per mantenere tutte le soluzioni e campioni di tessuto sul ghiaccio per conservare la vitalità mitocondriale. Anche quando mantenuto sul ghiaccio, mitocondri isolati esporranno una diminuzione dell'attività funzionale nel tempo ^19. Si raccomanda che tutte le soluzioni e le integrazioni essere pre-preparati. Abbiamo pre-pesare e immagazzinare Subtilisina A in 4 aliquote mg in 1,5 ml provette per microcentrifuga e conservare a …

Materials

Sucrose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit	Perkin Elmer	6016941
Equipment
50 mL Conical Tubes	BD	352098
40 μm Nylon Filters	BD	352340
GentleMACS C tube	Miltenyl Biotech	120-005-331
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 mm biopsy punch	Miltex	33-36
10 μm Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
GentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotech	130-093-235
96-well plates, tissue culture treated	VWR	82050-732
Rotomax 120 orbital shaker	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode  Microplate Reader	BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm System	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110