組織解離と差動濾過により移植のためにミトコンドリアの迅速な単離および精製
Summary
哺乳動物の組織生検からのミトコンドリアの迅速な単離のための方法が記載されている。ラット肝臓または骨格筋調製物は、商業的な組織解離をホモジナイズし、ミトコンドリアをナイロンメッシュフィルターを通して差動濾過により単離した。代替的な方法を用いて100分間 – ミトコンドリアの分離時間は60と比較して<30分である。
Abstract
以前に分画遠心法および/またはフィコール勾配遠心分離を用いてミトコンドリア単離方法が完了するまで60〜100分を必要とする。私たちは、商業組織の解離及び差動濾過を用いて、哺乳動物の生検からのミトコンドリアの迅速な単離のための方法を記載している。このプロトコルでは、手動の均質化は、組織解離の標準化された均質化サイクルに置き換えられる。これは、均一かつ簡単に手動均質化で達成されていない組織の一貫した均質化することができます。組織解離の後、ホモジネートを、繰り返し遠心分離工程を排除ナイロンメッシュフィルターを通して濾過する。結果として、ミトコンドリアの単離は、30分未満で行うことができる。この単離プロトコールは、0.18±0.04グラム（湿重量）組織サンプルから約2×10 10の生存および呼吸有能なミトコンドリアをもたらす。
Introduction
ミトコンドリアは、赤血球を除く体内のあらゆる細胞に存在し、重要な細胞及び代謝過程1-4の多数に関与している。そのため、これらの多くの機能により、ミトコンドリアの損傷は有害な影響3を持つことができます。ミトコンドリア機能および機能不全を調べるために、いくつかのミトコンドリアの単離方法が記載されている。 1940 5-8ミトコンドリアアイソ日の最も早い公表さを占めています。最初の文書化された試みは、低速5,8での塩溶液中で遠心分離し、乳鉢で肝組織を粉砕することにより、ミトコンドリアの単離を実証した。その後、他のグループは、元の手順の際に展開され、分画遠心6-8に基づいて、組織の分別を実証した。これらの初期の方法は、しばしば均質化、および/ または分画遠心9-15を組み込む現在の技術の基礎を形成した。 homogenizati数ステップにし、遠心分離プロトコルによって異なります。これらの反復的な手順では、ミトコンドリアの分離のための時間を増加させ、最終的には実行可能性を減らすことができます。正しく10,16を制御しない場合に加えて、手動の均質化は、ミトコンドリアの損傷や一貫性のない結果を引き起こす可能性があります。
最近では、心筋組織17,18への移植のためのミトコンドリアを分離するために均質化および分画遠心を使用していました。この長時間の単離手順は、約90分を要し、このメソッドの臨床的適用可能性は、したがって限られていた。臨床的および外科的治療の急性治療的使用を可能にするために、私たちは30分未満で行うことができる迅速なミトコンドリアの単離法を開発した。
このプロトコルの主な利点は、標準化された組織解離が均一かつ簡単に手動均質化で達成されていない組織の一貫した均質化を可能にすることである。 ADDITでイオン、分画遠心の代わりに、差動ろ過の使用は、時間がかかり、高度に精製された実行可能な呼吸有能なミトコンドリアのより迅速な単離を可能にする、繰り返しの遠心分離工程を排除します。
30分未満で生存可能であり、呼吸有能なミトコンドリアを単離する能力は、臨床応用が可能となる。この分離プロトコルは、冠動脈バイパスグラフト術（CABG）および他の治療手順において使用するための可能性を有する。
Protocol
Representative Results
Discussion
正常にこのプロトコルを使用してミトコンドリアを分離するためには、ミトコンドリアの生存能力を維持するために氷の上のすべてのソリューションおよび組織サンプルを維持することが不可欠である。氷上に維持した場合でも、単離されたミトコンドリアは、19時間にわたって機能的活性の減少を示すであろう。私たちは、すべてのソリューションや追加が事前に準備することをお…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立心臓、肺、血液研究所グラントHL-103542、およびCAPにBCH麻酔研究財団の識別トレイルブレイザー賞によってサポートされていました。
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84100 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Substilsin A | Sigma Aldrich | P5380 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit |
Perkin Elmer | 6016941 | |
| Equipment | |||
| 50 mL Conical Tubes | BD | 352098 | |
| 40 μm Nylon Filters | BD | 352340 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 mm biopsy punch | Miltex | 33-36 | |
| 10 μm Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| 96-well plates, tissue culture treated | VWR | 82050-732 | |
| Rotomax 120 orbital shaker | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader |
BioTek | ||
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
| Oxytherm System | Hansatech Instruments | ||
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
References
- van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
- Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317 (2011).
- Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
- Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
- Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
- Ernster, L., Schtaz, G. Mitochondria: a historical Review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
- Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
- McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
- Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
- Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
