조직 해리 차동 여과 이식 미토콘드리아의 신속한 분리 및 정제
Summary
포유 동물 조직 생검에서 미토콘드리아의 신속한 분리를위한 방법을 설명한다. 쥐 간 또는 골격근 제제 상용 조직 dissociator 균질화하고, 미토콘드리아는 나일론 메쉬 필터를 통한 여과에 의해 미분을 분리 하였다. 대안적인 방법을 사용하여 100 분간 – 미토콘드리아 분리 시간은 60 비교 <30 분이다.
Abstract
차동 원심 분리 및 / 또는 피콜 구배 원심 분리를 사용하여 이전에 기술 된 미토콘드리아 분리 방법은 완료 60-100 분을 필요로한다. 우리는 상업적 조직 dissociator 및 차등 여과하여 포유류의 조직 검사에서 미토콘드리아의 신속한 분리를위한 방법을 설명한다. 이 프로토콜에서 수동 균질화는 조직 dissociator의 표준화 균질화 사이클로 대체됩니다. 이 균일하고 쉽게 수동 균질화 달성되지 않은 조직의 일관성 균질화 수 있습니다. 티슈 해리 다음, 균질 반복 원심 분리 단계를 제거 나일론 메쉬 필터를 통해 여과된다. 그 결과, 미토콘드리아 절연은 30 분 미만으로 수행 될 수있다. 이 분리 프로토콜은 0.18 ± 0.04 g (습 중량) 조직 샘플에서 약 2 × 10 10 실행 가능하고 호흡 능력 미토콘드리아를 얻을 수 있습니다.
Introduction
미토콘드리아는 적혈구를 제외한 체내 모든 세포에 존재하는 세포 및 중요한 대사 과정 1-4의 다수에 관여한다. 때문에 이러한 많은 기능의 미토콘드리아 손상이 해로운 영향 삼을 수 있습니다. 미토콘드리아 기능 부전 여러 미토콘드리아 분리 방법을 조사하기 위해서 설명되었다. 1940 5-8로 미토콘드리아 격리 날짜의 최초의 공표를 차지한다. 제 문서화 시도가 저속 5,8에서 염 용액에 원심 분리 박격포 간 조직을 분쇄하여 미토콘드리아 아이솔레이션을 보여 주었다. 나중에, 다른 그룹은 원래의 절차에 따라 팽창 차등 원심 6-8에 기초하여 조직 분획을 보여 주었다. 이러한 초기 방법은 종종 균질화, 및 / 또는 차등 원심 9-15 통합 현재 기술의 기초를 형성. homogenizati의 수단계와 원심 분리 프로토콜마다 다릅니다. 이러한 반복적 인 단계들은 미토콘드리아 분리를 위해 시간을 증가시키고, 궁극적으로 생존 능력을 감소시킨다. 제대로 10,16 제어하지 않을 경우 또한, 수동 균질화는 미토콘드리아 손상과 일치하지 않는 결과가 발생할 수 있습니다.
최근에, 우리는 심근 조직 (17, 18)에 이식 미토콘드리아를 분리 균질화 및 차등 원심 분리를 사용했다. 이 긴 분리 절차를 수행하는 데 약 90 분을 요구하고이 방법의 임상 적용 가능성 때문에 제한되었다. 임상 및 수술 적 치료에서의 급성 치료 적 사용을 허용하기 위해, 우리는 30 분 미만으로 수행 될 수있는 신속한 미토콘드리아 분리 과정을 개발 하였다.
이 프로토콜의 주요 장점은 표준화 된 조직 해리가 균일하고 쉽게 수동 균질화 달성되지 않은 조직의 일관성 균질화 수 있다는 것입니다. 와 T에서이온 차등 원심 분리 대신에 차동 여과의 사용은 시간이 많이 소요되고 고도로 정제 실용적이고 유능한 미토콘드리아 호흡의 더 신속한 분리를 허용 반복 원심 분리 단계를 제거한다.
미만 30 분에 실행 가능하고 호흡 능력 미토콘드리아를 분리 할 수있는 능력은 임상 적 적용이 가능합니다. 이 분리 프로토콜은 관상 동맥 우회 이식 수술 (CABG) 등의 치료 과정에 사용 목적이 가능성이있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
성공적으로 미토콘드리아 생존을 유지하기 위해 얼음에 모든 솔루션과 조직 샘플을 유지하는 것이 필수적입니다이 프로토콜을 사용하여 미토콘드리아를 분리합니다. 얼음에서 유지하더라도, 절연 미토콘드리아는 19 시간에 걸쳐 기능적 활성의 감소를 나타내는 것이다. 우리는 솔루션 및 추가가 미리 준비하는 것이 좋습니다. 우리는 – 무게 사전 및 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 4 밀리?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 심장, 폐, 혈액 연구소 그랜트 HL- 103542, 그리고 CAP에 BCH 마취 연구 재단의 고유 선구자 상에 의해 지원되었다.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84100 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Substilsin A | Sigma Aldrich | P5380 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit |
Perkin Elmer | 6016941 | |
| Equipment | |||
| 50 mL Conical Tubes | BD | 352098 | |
| 40 μm Nylon Filters | BD | 352340 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 mm biopsy punch | Miltex | 33-36 | |
| 10 μm Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| 96-well plates, tissue culture treated | VWR | 82050-732 | |
| Rotomax 120 orbital shaker | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader |
BioTek | ||
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
| Oxytherm System | Hansatech Instruments | ||
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
References
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