Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

Summary

Um método para o isolamento rápido de mitocôndrias a partir de biópsias de tecidos de mamíferos é descrito. Preparações de fígado de rato ou de músculo esquelético foram homogeneizados com um Dissociator tecido comercial e mitocôndrias foram isoladas por meio de filtração através de filtros de diferencial de malha de nylon. Tempo de isolamento mitocondrial é <30 min, em comparação com 60 – 100 min utilizando métodos alternativos.

Abstract

Métodos de isolamento mitocondriais descritas anteriormente, utilizando centrifugação diferencial e / ou centrifugação em gradiente de Ficoll exigir de 60 a 100 min para completar. Descreve-se um método para o isolamento rápido de mitocôndrias a partir de biópsias de mamífero, utilizando um tecido comercial Dissociator filtração e diferencial. Neste protocolo, homogeneização manual é substituído por ciclo de homogeneização padronizada do Dissociator tecido. Isto permite uma uniforme e consistente homogeneização de tecido que não é facilmente conseguido com a homogeneização manual. Após a dissociação de tecidos, o produto homogeneizado é filtrado através de filtros de nylon de malha, o que elimina os passos de centrifugação repetitivas. Como resultado, o isolamento mitocondrial pode ser realizada em menos de 30 min. Este protocolo de isolamento rende aproximadamente 2 x 10 ¹⁰ mitocôndrias competentes viáveis ​​e respiratória de 0,18 ± 0,04 g (peso húmido) de uma amostra de tecido.

Introduction

As mitocôndrias existem em todas as células do corpo, excepto as células vermelhas do sangue e são envolvidos num grande número de importantes processos celulares e metabólicas ^1-4. Devido a estas várias funções, dano mitocondrial pode ter efeitos prejudiciais ^3. A fim de investigar a função mitocondrial e disfunção de vários métodos de isolamento mitocondriais foram descritos. Os primeiros relatos publicados de data isolamento mitocondrial à década de 1940 ^5-8. A primeira tentativa documentada demonstrado isolamento mitocondrial por trituração do tecido do fígado, num almofariz, seguido por centrifugação de uma solução de sal de ^5,8 a baixa velocidade. Mais tarde, outros grupos expandiu o procedimento original e demonstrou fraccionamento de tecido com base na centrifugação diferencial ^6-8. Estes métodos iniciais formaram a base das técnicas atuais que muitas vezes incorporam homogeneização e / ou centrifugação diferencial ^9-15. O número de homogenizatiem passos de centrifugação e varia entre protocolos. Estes passos repetitivos aumentar o tempo para o isolamento mitocondrial e, finalmente, reduzir a viabilidade. Além disso, a homogeneização manual pode causar danos e inconsistentes resultados mitocondriais se não for devidamente controlado ^10,16.

Recentemente, foi utilizado homogeneização e centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias para transplante no tecido do miocárdio ^17,18. Este procedimento de isolamento demorado necessário cerca de 90 min e a aplicabilidade clínica deste método era, portanto, limitado. Para possibilitar a utilização terapêutica aguda em tratamentos clínicos e cirúrgicos, desenvolvemos um procedimento de isolamento mitocondrial rápido que pode ser realizada em menos de 30 min.

Os principais benefícios deste protocolo são de que a dissociação do tecido padronizado permite uniforme e consistente homogeneização do tecido que não é facilmente alcançada com homogeneização manual. Em additião, o uso de filtração diferencial em lugar de centrifugação diferencial elimina demorado e passos de centrifugação repetitivas que permitam o isolamento de mitocôndrias mais rápida competentes altamente purificadas, viáveis ​​e respiratória.

A capacidade de isolar mitocôndrias competentes viáveis ​​e de respiração, em menos de 30 min permite a aplicabilidade clínica. Este protocolo de isolamento tem potencial para uso em cirurgia de revascularização do miocárdio (CRM) e outros procedimentos terapêuticos.

Protocol

Preparação Prepare 1 M K-HEPES da Solução (ajustar o pH para 7,2 com KOH). Prepare 0,5 M K-EGTA da Solução (ajustar o pH para 8,0 com KOH). Prepare 1 M KH 2 PO 4 da solução. Prepare 1 M MgCl2 da solução. Preparar tampão de homogeneização (pH 7,2) 300 mM de sacarose, 10 mM de K-HEPES, e 1 mM de K-EGTA. Armazenar a 4 ° C. Preparar tampão de respiração de 250 mM de sacarose, 2 mM de KH 2 PO 4,</sub…

Representative Results

A figura delinear os passos processuais no isolamento de mitocôndrias utilizando dissociação do tecido e filtração diferencial está representada na Figura 1. Tempo processual total é inferior a 30 min. As amostras de tecido foram obtidas utilizando um punch de 6 mm. O peso do tecido era de 0,18 ± 0,04 g (peso molhado). O número de mitocôndrias isoladas, como determinado por contagem de tamanho de partícula foi de 2,4 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mi…

Discussion

Para isolar com sucesso mitocôndrias que utilizam este protocolo é fundamental para manter todas as soluções e amostras de tecido em gelo para preservar a viabilidade mitocondrial. Mesmo quando mantidos em gelo, as mitocôndrias isoladas irá exibir uma diminuição na actividade funcional ao longo do tempo ^19. Recomendamos que todas as soluções e adições ser pré-preparado. Nós pré-pesar e armazenar Subtilisina A em alíquotas de 4 mg em 1,5 ml de tubos de microcentrífuga e armazená-las a -20 ° …

Materials

Sucrose	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit	Perkin Elmer	6016941
Equipment
50 mL Conical Tubes	BD	352098
40 μm Nylon Filters	BD	352340
GentleMACS C tube	Miltenyl Biotech	120-005-331
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 mm biopsy punch	Miltex	33-36
10 μm Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
GentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotech	130-093-235
96-well plates, tissue culture treated	VWR	82050-732
Rotomax 120 orbital shaker	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode  Microplate Reader	BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm System	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110