Быстрое Выделение и очистка митохондрий Для трансплантации тканью диссоциации и дифференциальной фильтрации
Summary
Способ быстрого выделения митохондрий из млекопитающих биопсии тканей описан. Печень крысы или скелетные мышечные препараты гомогенизировали с коммерческой диссоциатора ткани и митохондрии были изолированы с помощью дифференциальной фильтрацией через нейлоновое сито фильтров. Митохондриальная время изоляция <30 мин по сравнению с 60 – 100 мин с использованием альтернативных методов.
Abstract
Ранее описанные способы митохондриальные выделения с использованием дифференциального центрифугирования и / или центрифугирование в градиенте Ficoll требуют от 60 до 100 мин, чтобы закончить. Опишем способ быстрого выделения митохондрий от биопсии млекопитающих с использованием коммерческого диссоциатор тканей и дифференциальный фильтрации. В этом протоколе, руководство гомогенизации заменяется стандартизированной цикла гомогенизации ткани диссоциатора в. Это позволяет единообразно и последовательно гомогенизации ткани, которая не легко достигается с ручным гомогенизации. После диссоциации ткани, гомогенат фильтруют через нейлоновое сито фильтров, которые устраняют повторяющиеся стадии центрифугирования. В результате, митохондриальная изоляция может быть выполнена менее чем за 30 мин. Этот протокол изоляция производится около 2 х 10 10 жизнеспособных и дыхания компетентные митохондрии от 0,18 ± 0,04 г (сырого веса) образца ткани.
Introduction
Существуют Митохондрии в каждой клетке тела, кроме эритроцитов и участвуют в большом количестве важных клеточных и метаболических процессов 1-4. Из этих многих функций, повреждение митохондрий может иметь пагубные последствия 3. Для исследования митохондриальной функции и дисфункции несколько митохондриальных методы изоляции были описаны. Самые ранние опубликованные описания митохондриальной даты изоляции до 1940 5-8. Первый документально показано, попытка митохондриальной изоляцию путем измельчения ткани печени в ступке с последующим центрифугированием в солевом растворе с низкой скоростью 5,8. Позже, другие группы расширены оригинальной методике и продемонстрировал тканей фракционирования на основе дифференциального центрифугирования 6-8. Эти ранние методы легли в основу современных методов, которые часто включают гомогенизации и / или дифференциального центрифугирования 9-15. Количество homogenizatiна и центрифугирования шагов варьируется среди протоколов. Эти повторяющиеся стадии увеличить время для митохондриальной изоляции и в конечном итоге сократить жизнеспособность. Кроме того, руководство гомогенизации может привести к повреждению и противоречивые результаты митохондриальные если должным образом не контролируется 10,16.
В последнее время мы использовали гомогенизации и дифференциального центрифугирования изолировать митохондрии для трансплантации в ткани миокарда 17,18. Это длительная процедура изоляции требуется примерно 90 мин и клиническая применимость этого метода был поэтому ограничены. Для обеспечения острой терапевтического применения в клинической и хирургического лечения мы разработали быстрый митохондриальной процедуры выделения, которые могут быть выполнены в менее чем 30 мин.
Основные преимущества этого протокола, что стандартизированный ткани диссоциации позволяет единообразно и последовательно гомогенизации ткани, которая не легко достигается с ручным гомогенизации. В Additионный, использование дифференциального фильтрации вместо дифференциального центрифугирования устраняет много времени и повторяющиеся действия центрифугирования позволяет более быстрого выделения высокоочищенных, жизнеспособных и дыхания компетентных митохондрий.
Возможность изолировать жизнеспособные и дыхания компетентные митохондрии менее чем 30 мин позволяет клинической применимости. Этот протокол изоляция имеет потенциал для использования в аортокоронарное шунтирование операции (АКШ) и других лечебных процедур.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы успешно изолировать митохондрии, используя этот протокол, его необходимо держать все решения и образцы тканей на льду, чтобы сохранить митохондриальную жизнеспособность. Даже тогда, когда поддерживается на льду, изолированные митохондрии будут демонстрировать уменьшение функ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальным сердца, легких и крови институт Грант HL- 103542, и заслуженный Trailblazer Award МПБ Анестезия Фонда Исследования к CAP.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84100 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Substilsin A | Sigma Aldrich | P5380 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite Luminescence Assay System, 1000 Assay Kit |
Perkin Elmer | 6016941 | |
| Equipment | |||
| 50 mL Conical Tubes | BD | 352098 | |
| 40 μm Nylon Filters | BD | 352340 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 mm biopsy punch | Miltex | 33-36 | |
| 10 μm Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| 96-well plates, tissue culture treated | VWR | 82050-732 | |
| Rotomax 120 orbital shaker | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader |
BioTek | ||
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
| Oxytherm System | Hansatech Instruments | ||
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
References
- van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
- Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317 (2011).
- Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
- Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
- Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
- Ernster, L., Schtaz, G. Mitochondria: a historical Review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
- Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
- McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
- Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
- Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
