الميكروسكيل Electroporator لتوصيل متسلسل الجزيئية بمساعدة دوامة
Summary
ووضعت دوامة ميكروفلويديك منصة Electroporation للمساعدة للتسليم متتابعة من الجزيئات متعددة في السكان الخلية متطابقة مع التحكم جرعة دقيقة ومستقلة. حجم استنادا خطوة تنقية الخلية المستهدفة Electroporation للسبقت النظام ساعد على تعزيز كفاءة تسليم الجزيئية وبقاء الخلية المصنعة.
Abstract
تلقت Electroporation للباهتمام متزايد في السنوات الماضية، لأنها هي تقنية قوية جدا لإدخال جسديا تحقيقات الجزيئية الخارجية غير نفيذ في الخلايا. تقارير هذا العمل منصة Electroporation للميكروفلويديك قادرة على أداء العديد تسليم جزيء إلى خلايا الثدييات مع مراقبة دقيقة والمعلمة الجزيئية التي تعتمد على. قدرة النظام على عزل الخلايا مع توزيع حجم موحد يسمح لأقل من التباين في كفاءة Electroporation للفي نظرا لقوة الحقل الكهربائي. وبالتالي تعزيز قابلية العينة. وعلاوة على ذلك، تتيح ميزة عملية التصور من أجل مراقبة عملية امتصاص الجزيئية فلوري في الوقت الحقيقي، والذي يسمح الجزيئية التعديلات المعلمة التسليم الفوري في الموقع لتعزيز الكفاءة. لإظهار قدرات العظمى من منصة عنها، الجزيئات ذات أحجام مختلفة والشحنات الكهربائية (مثل ديكستران مع ميغاواط من 3،000 و 70،000 دا) كانتتسليمها إلى خلايا سرطان الثدي النقيلي مع الكفاءات تسليم عالية (> 70٪) لجميع الجزيئات التي تم اختبارها. وقد أثبتت منصة وضعت إمكاناتها لاستخدامها في توسيع مجالات البحث حيث Electroporation للتقنيات يمكن أن تكون مفيدة على رقاقة.
Introduction
في السنوات الأخيرة، أصبح استخدام النبضات الكهربائية لتسهيل تسليم عصاري خلوي من الجزيئات خارج الخلية وسيلة جذابة بالتلاعب خلايا الثدييات. 1 هذه العملية، التي تعرف أيضا باسم Electroporation لل، permeabilizes عكسية الغشاء الخلوي، مما يسمح للجزيئات الغشاء بطبيعتها غير منفذة للوصول الوسط بين الخلايا إلى الخلايا. لأنه يمكن إدخال تقريبا أي جزيء في العصارة الخلوية عبر خلق المسام مؤقتة في غشاء من أي نوع من الخلايا باستخدام Electroporation لل، تم الإبلاغ عن هذه التقنية بأنها أكثر استنساخه، قابلة للتطبيق عالميا، وأكثر كفاءة من الطرق الأخرى بما في ذلك بوساطة فيروس والكيميائية والنهج البصرية. 2-3 وقد استخدمت هذه التقنية لإدخال جزيئات الفلورسنت، 4 5 المخدرات والأحماض النووية 6-7 مع الحفاظ على خلايا قابلة للحياة وسليمة. ونظرا لهذه الفوائد، اعتمد Electroporation للباعتباره العمل المشتركatory تقنية الحمض النووي لترنسفكأيشن، في الجسم الحي العلاج الجيني 8 والدراسات التطعيم الخلية. هو عليه، ومع ذلك، لا يزال من الصعب على Electroporation للأنظمة التقليدية في وقت واحد لتحقيق الكفاءة والجدوى العملية للعينات مع عدم تجانس كبير الحجم بسبب قوة الحقل الكهربائي اللازمة ل electroporation الناجح يرتبط بشكل وثيق مع قطر الخلية. وعلاوة على ذلك، تلك النظم لا تسمح مراقبة دقيقة من المبالغ الجزيئية متعددة يجري تسليمها بسبب الاعتماد على السائبة العشوائية عملية التسليم الجزيئية. 9 ومن أجل معالجة هذه القضايا، وضعت العديد من المجموعات منصات Electroporation للميكروفلويديك، وتقدم ميزة انخفاض الفولتية poration، أفضل كفاءة ترنسفكأيشن، وتخفيض كبير في معدل وفيات خلية، والقدرة على تقديم جزيئات متعددة وأدلى 10-13 هذه المزايا من الممكن نظرا لآثار أقدام صغيرة من أنظمة Electroporation للالميكروسكيل الذين الملعب قطب كهربائيأطوال هي ملليمتر الفرعية، والحد بشكل كبير الفولتية المطلوبة للتسليم ناجحة. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذه النظم Electroporation للالميكروسكيل تحقيق توزيع الحقل الكهربائي موحد وسريع تبديد الحرارة المتولدة، مما أسفر عن انخفاض معدل وفيات خلية مع تعزيز كفاءة التسليم. استخدام مواد شفافة لهذه الرقائق مزيد يسمح الرصد الموقعي لعملية Electroporation للللتعديلات المعلمة سريعة في. 2،12 ومع ذلك، ومراقبة دقيقة والجرعة الجزيئي والخلوي التي تعتمد على السيطرة المعلمة، اللازمة لالناشئة البحوث والتطبيقات العلاجية، 6، 14-16 لا تزال دون حل.
ويعرض هذا العمل نظام Electroporation للميكروفلويديك بمساعدة دوامة، قادرة على تقديم جزيئات متعددة بالتتابع إلى السكان متطابقة سبق اختيارهم من الخلايا المستهدفة. يتم عزل الخلايا مع توزيع حجم موحدة قبل Electroporation للاستخدام الاشتراكية عنها سابقا-زي انتقائية آلية محاصرة. 17-18 من خلال وجود توزيع موحد الحجم والتباين أقل في الكفاءة وتعزيز Electroporation للبقاء في نظرا لقوة الحقل الكهربائي تحققت 19 وعلاوة على ذلك، التحريض باستمرار خلايا المحاصرين باستخدام الدوامات الميكروسكيل سمحت للتسليم موحد للجزيئات عبر العصارة الخلوية بأكملها، بالاتفاق مع النتائج المعلنة سابقا باستخدام منصة أخرى بمساعدة دوامة Electroporation لل20 لإثبات أن هذا النظام سيكون ينطبق على مجموعة واسعة من الجزيئات المستخدمة عادة في التطبيقات البيولوجية والجزيئات مع مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية تم تسليمها إلى خلايا سرطان الثدي النقيلي. بالإضافة إلى ذلك، مع المعونة من عملية الرصد في الوقت الحقيقي، وهذا العمل يوفر المزيد من الأدلة لوضع حد للجدل منذ وقت طويل بشأن آلية تسليم الجزيئي خلال electrporation، ويجري في الغالب الكهربائي بوساطة مقابل بوساطة نشر 14 </sup> خلافا للأنظمة Electroporation للأخرى، وهذا يوفر منصة فريدة المزايا مجتمعة من الدقيق تسليم متعددة الجزيء، وارتفاع كفاءة الجزيئية التسليم، الحد الأدنى من الوفيات الخليوي، وتمتد واسعة من حجم والرسوم جزيئات تسليمها، فضلا عن التصور في الوقت الحقيقي من Electroporation لل العملية. ونظرا لهذه الإمكانات، ونظام Electroporation للالمتقدمة لديها امكانات العملية كأداة تنوعا للدراسات إعادة برمجة الخلايا، وتطبيقات تسليم المخدرات 10،19 6،14،21-22 والتطبيقات التي تتطلب لفهم متعمق من الآليات الجزيئية Electroporation للتسليم.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع منصة Electroporation للبشكل متوازي جديدة، وتعزيز 10 أضعاف في الإنتاجية والكفاءة في تقديم متعددة جزيء تم تحقيقه بالإضافة إلى جميع المزايا التي يوفرها نظام غرفة واحدة وضعت سابقا. تشمل 18 المزايا المتاحة سابقا (ط) قبل تنقية استهداف الخلايا مع توزيع موحد لتعزيز حجم جدوى،…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويؤيد هذا العمل من قبل برنامج رولاند زميل جديد. فإن الكتاب أود أن أعرب عن امتناني للعلماء والموظفين في معهد رولاند في جامعة هارفارد: كريس ستوكس لمساعدته في تطوير مبنية خصيصا، بمساعدة الحاسوب الإعداد السيطرة على ضغط، وديان Schaak، دكتوراه لها مدخل للتعامل مع عينة البيولوجي، وينفيلد هيل لتطوير الإعداد الكهربائية، Alavaro سانشيز، دكتوراه لمنح الوصول إلى تدفق عداد الكريات، سكوت بيفيس، كيني روجرز دون سبنسر وبالقطع لمكونات السباكة الميكانيكية اللازمة لإعداد الضغط. ملفقة الماجستير ميكروفلويديك في مركز لأنظمة النانو (CNS) في جامعة هارفارد.
Materials
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| high-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32"ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluiminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 mL centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J. Micro-/nanofluidics based cell electroporation. Biomicrofluidics. 7, (2013).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. Vortex-assisted DNA delivery. Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
