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Introduction
대규모 병렬 리포터 분석 실험은 (MPRA)는 DNA 서열 1 (7)을 수천 수백 수천의 전사 규제 활동의 다중 측정을 할 수 있습니다. 자신의 가장 일반적인 실시 예에서, 다중화는 오픈 리딩 프레임의 하류 서열 식별 태그가 포함되어 합성 리포터 유전자를 관심있는 각각의 시퀀스를 연결함으로써 달성된다 (ORF를,도 1). 형질 감염, RNA 분리 및 리포터 유전자 전 사체의 3 '말단의 깊이 순서화에 따라, 결합 된 서열의 상대적인 활동은 식별 태그의 상대적인 풍부로부터 추론 될 수있다.
MPRA의 그림 1 개요. MPRA 기자의 라이브러리는 합성으로 추정 조절 서열을 결합하여 구성되어 구축서열 식별 태그 뒤에 (예로서 루시페라아제 또는 GFP) "불활성"ORF로 구성 리포터 유전자. 도서관은 배양 된 세포의 인구에 대거 형질 전환하고, 전사 리포터 mRNA를 연속적으로 회수한다. 깊은 순서는 기자의 mRNA와 형질 전환 된 플라스미드 중 각 태그의 발생 수를 계산하는 데 사용됩니다. 플라스미드 카운트 대응하는 조절 서열의 활성을 추정하는 데 사용될 수있는 동안의 mRNA의 비를 계산. 멜린 니코의 허가를 적응, 등 2.
MPRA은 관심 궤적 걸쳐 신규 조절 요소에 대해 개별 유전자 조절 요소는 1) 광범위한 돌연변이 유발, 2) 주사를 포함하여, 실험 다양한 설계에 적용 할 수 있으며, 3) 추정의 세트 천연 유전 적 변이의 효과를 테스트 프로모터, 인핸서 또는 소음기, 합성 규제 요소 사) 반 합리적인 엔지니어링. 리시퀀스 변종 braries은 퇴화 올리고 1,4, 조합 결찰 8 게놈 DNA 5의 조각화 올리고 뉴클레오티드 라이브러리 프로그램 마이크로 어레이 2,3,6,7-에 합성 (OLS), 조립 등 다양한 방법을 사용하여 생성 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 프로모터의 라이브러리의 구조를 설명 변종 OLS와 pMPRA1 및 pMPRAdonor1 벡터 (각각 Addgene ID를 49349 및 49352; http://www.addgene.org)를 사용하여, 배양 된 포유류 세포 및 후속 정량에이 라이브러리의 일시 발현을 관련 태그의 깊은 시퀀싱 (태그-SEQ)에 의해 프로모터 활동. 이 프로토콜의 이전 버전 (2013) 연구 23, 800-811 멜린 니코 등. 자연 생명 공학 30, 271-277 (2012)과 Kheradpour 등. 게놈에보고 된 연구에 사용되었다.
Protocol
1 시퀀스 설계 및 합성
- 시퀀스의 설계 및 합성에 MPRA 시작은 규제 활동을 분석합니다. pMPRA 벡터 시리즈와의 호환성을 위해 다음과 같은 템플릿을 사용하여 각 시퀀스를 설계 : 5'-ACTGGCCGCTTCACTG- var에 -GGTACCTCTAGA- 태그 -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 var에 정량 할 수있는 순서를 나타내며, 태그는 하나 이상의 식별 태그를 의미한다 '.
- 이 가변 영역 (VAR 및 태그) 사이 리포터 유전자 단편의 방향을 용이하게 결찰를 KpnI (GGTACC)과를 XbaI (TCTAGA) 제한 부위의 쌍에 의해 분리된다. 또한, 두 가지 SfiI (GGCCNNNNNGGCC) 사이트는 pMPRA 백본으로 방향 결찰 할 수 있도록 PCR에 의해 추가됩니다. 변수 영역이 제한 부위의 사본을 추가로 포함 할 수 없습니다. 필요한 경우, 이들 제한 효소 중 하나 이상을 대체 할 수있다만큼 대체품으로서 1) 주변 DNA 분자의 말단에 효율적인 절단을 허용하고, 2) 벡터 시퀀스의 다른 곳에서 절단되지 않는다. 자세한 내용에 대한 설명을 참조하십시오.
- 상용 공급 업체에서 표 1에 필요한 프라이머를 얻습니다.
MPRA_SfiI_F | GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG |
MPRA_SfiI_R | GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC |
TAGseq_P1 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT |
TAGseq_P2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [인덱스] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG |
표 1 프라이머 서열. [색인] 다중화 시퀀싱에 사용될 6-8 NT 인덱스 시퀀스를 나타낸다. 다른 인덱스 적어도 8 TagSeq-P2 프라이머를 얻습니다. 모든프라이머의 HPLC 또는 PAGE로 정제해야한다.
- 올리고 뉴클레오티드 라이브러리는 상업적 공급 업체 또는 코어 설비로부터 얻어진, 또는 제조자에 의해 설명 된 바와 같이 프로그램 가능한 마이크로 어레이 계 올리고 뉴클레오티드 합성기를 사용하여 생성 될 수있다. 100 ㎕의 TE 0.1 버퍼에 OLS 제품을 재현 탁.
- 폴리 아크릴 아미드 겔을 변성 10 % TBE-우레아에 올리고 뉴클레오티드 라이브러리를 실행. 품질 (그림 2A)를 평가하는 ssDNA의 민감한 형광 얼룩 차선 얼룩 당 약 1 pmol의를 넣습니다.
- 전체 길이의 올리고 뉴클레오티드에 대응 이산 밴드 시각화 할 수있는 경우 (도 2a, 레인 1과 2), 대응 아크릴 아미드 겔 슬라이스를 절제하고 진탕하면서 실온에서 밤새 100 ㎕의 TE 0.1로 올리고 뉴클레오티드를 용출. 그렇지 않으면, 원시 OLS 서스펜션을 사용하여 진행합니다.
- PCR 증폭 9 에멀젼을 이용한 올리고 뉴클레오티드 라이브러리 SfiI 꼬리를 추가 > SUP.
- 표 2에 설명 된대로 50 ㎕의 PCR 반응 혼합물을 설정합니다. 다음 4 ℃에서 5 분 동안 300 ㎕의 Micellula DNA 에멀젼에서 오일과 계면 활성제 혼합물의 정제 키트와 소용돌이와 결합.
시약 | 1X 볼륨 (μL) |
Herculase II 퓨전 DNA 중합 효소 | 0.5 |
5 배 Herculase II 반응 버퍼 | 10 |
의 dNTP (10 mM의 각) | 1.25 |
BSA (20 ㎎ / ㎖) | 1.25 |
프라이머 MPRA_SfiI_F (25 μM) | 0.25 |
프라이머 MPRA_SfiI_R (25 μM) | 0.25 |
OLS 템플릿 (1-10 attomol) | 변화 |
핵산 분해 효소가없는 물 | 50 |
- 생성물의 외관없이 증폭 생성물의 최대 수율을 제공 농도를 사용하여 (섹션 1.12 참조).
- PCR 튜브에 생성 된 에멀젼을 분배하고 95 ° C에서 (2 분 PCR의 20주기를 수행, 20 × 95 ° C에서 20 초, 55 ° C, 72 ° C에서 30 초에서 20 초], 95시 3 분 ° C).
- 풀 텍싱 간단히 1 ㎖의 이소 부탄올을 첨가하여 각각의 350 μL 에멀젼 PCR 반응을 중단 한 후 DNA 정제 컬럼을 사용하여 증폭 산물을 정제하고.
- 유물없는 증폭 (그림 2B)를 확인하기 위해 2 % 또는 4 % 아가로 오스 겔에 나누어를 실행합니다.
올리고 뉴클레오티드 합성 라이브러리의 그림 2 준비.) B)로 직접 이동 제품. 복잡한 올리고 뉴클레오티드 라이브러리의 PCR 증폭 자주 키메라 제품과 상한 및 하한 밴드로 나타날 수 있습니다 다른 아티팩트를 생성합니다. 에멀젼 PCR은 이러한 아티팩트를 최소화 할 수 있습니다.
2 라이브러리 생성
- , 1 % 아가 로스 겔상에서 실행 2 시간, 50 ° C에서 SfiI으로 분해 벡터 pMPRA1 의해 선형화 된 플라스미드 백본을 준비한다 (이 경우, 2.5 KB 단위) 백본 밴드를 절제하고, 겔 정제 스핀 컬럼을 사용하여 정제.
- 다이제스트2 시간 동안 50 ° C에서 SfiI와 단계 1.4에서 에멀젼 PCR 제품과는 DNA 정제 컬럼을 사용하여 정제.
- , 선형화 된 벡터 백본에 프로모터 태그 라이브러리를 결찰하기 위해 소화 PCR 제품의 100 NG, 선형화 된 벡터 백본 및 T4 DNA 리가 아제의 50 NG를 포함하는 반응을 설정합니다. 20 분 리가을 비활성화하는 65 ° C에서 다음 열을 16 ° C에서 밤새 품어.
- E. 변환 연결 반응으로 대장균. 라이브러리 복잡성을 유지하기 위해, 설계 라이브러리에있는 개별의 프로모터 태그 조합이보다 적어도 10 배 더 CFU를 획득하는 것을 목표로하고 있습니다.
- 태그의 총 개수가 약 10 인 경우, 타겟은 전형적으로 도서관 CFU 당 6-8 병렬 변환을 수행함으로써 달성 될 수있다.
- 각 변환의 경우, E. electrocompetent 50 μl를 결합 얼음에 결찰 믹스의 2 μL와 대장균 세포. 800 μL의 SOC에 세포를 전기 천공에 의해 변형 복구병렬 변환에서 세포를 결합 후 1 시간 동안 37 ° C에서 흔들어, 그리고에 의해 매체.
- 변환 효율을 평가하기 위해 50 ~ 100 μg / ml의 카르 베니 실린와 LB 아가 플레이트에 복구 된 세포의 alinquot에서 순차적으로 희석 플레이트 하룻밤에 37 ° C를 품어. / V, V 복구 세포와 V의 전체 볼륨 시리얼 희석 걸리는 나누어의 볼륨 - 총 CFU로 (관찰 CFU) × (희석 계수) × (V V)를 추정한다.
- 동시에, 회수 된 세포의 나머지가 100 μg / ml의 카르 베니 실린이 보충 된 200 ㎖의 LB에 접종하는 데 사용. 진탕 배양기에서 하룻밤 37 ° C에서 세포를 성장하고 표준 절차에 따라 플라스미드 DNA를 분리.
- 2 시간 동안 50 ° C에서 SfiI으로 절연 플라스미드 라이브러리의 분취 다이제스트와 삽입물의 존재를 확인하는 1 % 아가 로스 겔상에서 실행.
- C에 의해 플라스미드 라이브러리를 선형화를 KpnI과 XbaI로를 사용하여 프로모터 변종와 태그 사이에 utting. 소화 효율을 극대화하기 위해, 일련 digestions를 수행
- 첫째, 1 시간 동안 37 ° C에서 KpnI에서 다이제스트 및 자기 구슬을 사용하여 정제. 둘째, 2 시간 동안 37 ° C에서 1 U 새우 알칼리 포스 파타 아제의 첨가를 XbaI으로 소화, 열은 5 분 동안 65 ° C에서 비활성화 한 다음 자석 구슬을 사용하여 정제.
- 완전한 선형화를 확인하는 1 % 아가 로스 겔상에서 분취 액을 실행. 미가공 플라스미드가 보이면, 선형화 된 단편을 겔 정제한다.
- 포유 동물 세포에 형질 전환에 적합한 MPRA 라이브러리를 생성하기 위해, 선형화 된 중간 라이브러리에 KpnI으로 절단 / XbaI으로 호환 끝으로 ORF를 결찰.
- pMPRAdonor1에서 호환 luc2 ORF 부분을 준비하려면 1 시간 동안 37 ° C에서를 KpnI과 XbaI으로이 플라스미드를 소화하고 1 % 아가 로스 젤에서 실행됩니다. ORF 부분을 절제 (1.7 K이 경우, b) 및 겔 정제 스핀 컬럼을 사용하여 정제.
- 단계 2.3-2.8에서 설명한 바와 같이 선형화 된 라이브러리에 중간 ORF 단편을 복제.
- 1 시간 동안 37 ° C에서 KpnI으로 절단과 MPRA 라이브러리 (1-2 μg에 해당) 나누어지는 다이제스트와 1 % 아가 로스 젤에서 실행됩니다. 소화 라이브러리가 하나의 밴드로 실행하면 추가 밴드가 (일반적으로 중간 구조의 이월에 해당), 라이브러리는 다음과 같이 추가로 정제 할 수있다 관찰하는 경우, 섹션 3으로 진행합니다 :
- 1 시간 동안 37 ° C에서 KpnI으로 절단으로 오염 된 라이브러리의 3-5 μg을 소화하고 4 ℃에서 하룻밤 0.8 % 아가로 오스 겔에서 실행됩니다.
- 올바른 라이브러리 밴드를 절제 겔 정제 스핀 컬럼을 사용하여 DNA를 정제하고, 1 시간 동안 37 ° C에서 고농도의 T4 DNA 리가 아제를 이용하여자가 결찰을 수행한다. 단계 2.8에 설명 된대로 그런 다음 변환 및 최종 라이브러리 DNA 분리를 반복합니다.
3 Transfection, 동요 및 RNA 분리
- 각각의 독립적 인 형질 감염, 적절한 배양 배지에서 세포를 필요 매수 (MPRA 라이브러리의 복잡성에 의해 결정된 바와 같이, 논의 참조). 예를 들어, DMEM에서 배양 HEK293T / 17 세포를 10 % FBS 및 L-글루타민 / 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충. 각 라이브러리 및 실험 조건에 대한 적어도 두 개의 독립적 인 형질 감염을위한 세포를 배양.
- MPRA 플라스미드와 함께 배양 된 세포를 형질. 형질 전환 방법 및 조건은 각 세포 유형에 맞게 최적화해야합니다. 각 형질 샘플 들어, 정합 제어로서 플라스미드 DNA의 분취 액 (50-100 NG)를 유지한다.
- 예를 들어, 0.5 × 10 7 HEK293T / 성장 17 세포를 형질에 ~ 나는 30 ㎕의 리포 펙 타민 LTX 10 μL 플러스 시약을 사용하여 혈청 중 감소 된 1 ml의 옵티-MEM에서 10 μg 플라스미드 DNA와 10cm 배양 접시에 50 %의 합류. 5시간 후 형질 전환 혼합물을 제거하고 허용세포는 24 ~ 48 시간 동안 복구 할 수 있습니다.
- 선택적으로, 설계 라이브러리의 상황에 또는 신호에 의존하는 조절 서열을 활성화하는 데 필요한 교란을 수행합니다.
- 세포를 수확과 제조업체의 지침을 사용하여 표준 올리고 (DT) 셀룰로오스 열 또는 구슬을 사용하여 폴리 (A) + mRNA를을 격리 할 것.
- 열 또는 구슬의 최대 결합 용량이 수확 한 세포에서 mRNA의 예상 총 금액을 초과 할 수 있는지 확인합니다. 예를 들어, 3.3에서 기대 수익률은 약 0.5 내지 2.5 μg의 mRNA이다.
4 태그-SEQ
- 형질 세포 용 해물에서 벡터 DNA의 이월을 제거하기 위해 2.4 ㎕의 터보 DNase의 불 활성화 시약을 1 시간 동안 37 ° C에서 1 μL 터보 DNase의 (2 U) 및 2.3 ㎕의 10 배 터보 DNase의 버퍼 각 20 μL mRNA의 샘플을 처리 추가 RT 후 5 분간 혼합과 90 초간 원심 분리기에 10,000그램 및 위해 신선한 용액 튜브에 옮긴다.
- 확인 아가로 오스 겔상에서의 제품을 각각의 mRNA 시료 60-100 ng의 섹션 4.6에 설명 된 바와 같이 PCR을 수행하고 실행하여 순도. (luc2와 pMPRA1를 사용하는 경우 0.25 킬로바이트) 특정 증폭 산물을 볼 수있는 경우, 열은 치료의 mRNA를 정제 한 후 DNase를 처리를 반복합니다.
- , 태그-SEQ 시퀀싱 라이브러리를 생성하는 cDNA에 기자의 mRNA를 변환 PCR에 의해 시퀀싱 어댑터를 추가합니다.
- 표 3에 설명 된대로의 mRNA / RT 프라이머 혼합물을 설정합니다. 다음 얼음에 놓고 5 분 동안 65 ° C에서 품어. 표 4에 설명 된대로 병행하여, cDNA 합성 반응을 설정합니다.
시약 | 1X 볼륨 (μL) |
mRNA의 샘플 (400-700 NG 전체) | 8 |
올리고 0dT (50 μM) | 1 |
의 dNTP (10 mM의 각) | 1 |
시약 | 1X 볼륨 (μL) |
10 배 첨자 III RT 버퍼 | 이 |
MgCl2를 (25 밀리미터) | 4 |
DTT (0.1 M) | 이 |
RNaseOut (40 U / μL) | 1 |
첨자 III (200 U / μL) | 1 |
표 4의 cDNA 합성 반응 믹스.
- 조심스럽게 mRNA의 / RT 프라이머 cDNA 합성 믹스와 혼합 결합한다. 50 분, 5 분, 85 ° C, 50 ° C에서 부화 한 후 얼음에 배치합니다. 마지막으로, 20 분 동안 37 ° C에서 2 U 리보 뉴 클레아 제의 H와 부화.
- 4-6 μL와 표 5에 설명 된대로 PCR 반응을 설정cDNA의 반응 혼합물 또는 템플릿으로 50 ng의 리포터 플라스미드. 그런 다음 PCR 증폭 (2 분 95 ° C, 26 X [30 초 동안 95 ° C, 30 초 30 초 동안 55 ° C, 72 ° C], 3 분 동안 72 ° C)를 수행합니다.
시약 | 1X 볼륨 (μL) |
배 PfuUltra II HotStart PCR 마스터 믹스 | 25 |
프라이머 TagSeq_P1 (25 μM) | 0.5 |
프라이머 TagSeq_P2 (25 μM) | 0.5 |
템플릿 (mRNA를 cDNA를 혼합 또는 플라스미드 DNA) | 변화 |
핵산 분해 효소가없는 물 | 50 |
표 5 태그-SEQ PCR 반응 혼합물.
- 2 % 아가 로스 젤 PCR 제품을 실행 태그-SEQ 라이브러리 증폭 산물에 해당하는 소비세 밴드 (0.25 킬로바이트 사용하는 경우luc2와 pMPRA1) 및 이들의 겔 정화 스핀 열을 정화.
- 수영장, 변성 및 Illumina의 시퀀싱 기기와 직접 정제 된 태그-SEQ 증폭 산물을 시퀀싱.
- 필터 저품질는 시퀀스 태그 내에 30 개 미만의 점수 또는 b) 정확하게 설계된 태그가 일치하지 않는 Phred 품질로 하나 이상의 위치를 포함) 모두를 제거하여 판독한다. 나머지 각 태그는 각 도서관에 나타나는 횟수를 계산합니다. TPM에 (백만 시퀀싱 태그 당 태그) 태그 카운트를 정규화 한 후 시퀀싱 라이브러리의 각 쌍에 대한 플라스미드 유래 태그 카운트 위에 유래의 mRNA 태그 카운트의 비율을 계산한다. 서로 다른 여러 태그를 각 시퀀스 변종에 연결 한 경우, 다운 스트림 분석을 위해 자신의 평균 비율을 사용합니다.
Representative Results
MPRA 고해상도, 전사 조절 요소의 시퀀스 - 활성 관계를 정량적으로 절개를 용이하게한다. 성공적인 MPRA 실험은 전형적으로 형질 라이브러리 (도 3a)에서 서열의 대부분 고도로 재현 가능한 측정 값을 수득한다. 나쁨 재현성 (도 3b)이 관찰되는 경우, 이는 정량 서열 중 하나) 낮은 절대 활성, 또는 2) 낮은 형질 감염 효율 하나에, 회수 된 RNA 샘플에서 리포터의 mRNA 너무 낮은 농도를 나타낸다.
도 4는 시금 생성 대표적인 "공간 정보"를 보여준다 ~ 1,2 또는 센다이 바이러스에의 노출없이 HEK293 세포에서 인간 IFNB 유전자의 상류에 145 bp의 서열의 임의의 변형 37000. 발기인 TATA 박스 알려진 근위 증강 (10)는 명확하게 정보가 풍부한 REGI으로 식별 할 수 있습니다바이러스 의존적으로 기능.
그림 3 태그-SEQ 재현성. 고 (A)과 낮은 (B) 재현성이 독립적 인 복제 형질에서 태그-SEQ 데이터의 예를 나타내는 산포도. 후자의 플롯은 반복에의 한 높은 mRNA의 수가 많은 아웃 라이어의 태그를 보여줍니다. 이러한 유물은 일반적으로 기자의 mRNA의 농도 인해 기자의 구조 중 낮은 절대 활동, 또는 낮은 형질 전환 효율에 하나, 정량적 PCR 증폭 너무 낮았다을 나타냅니다.
인간의 IFNB 전사 시작 사이트와 근위 증강의 그림 4 정보 배출량 측정. IFNB 인간 유전자의 뉴클레오티드 145 (NT) 영역의 약 37,000 랜덤 변형 (A)로 및 센다이 바이러스 (B)의 노출없이 HEK293 세포를 사용 MPRA 분석 하였다. 파란색 막대는 각 위치에서 리포터 출력 및 뉴클레오타이드 간의 상호 정보를 나타낸다. 근위 증강 및 TATA 박스는 바이러스 감염시 높은 정보 콘텐츠의 영역으로 눈에 띄는.
Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 상을 수 R01HG006785에서 국립 보건원 (NIH)의 국립 인간 게놈 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Oligonucleotide library synthesis | Agilent, CustomArray, or other OLS vendors | custom | If using OLS construction method |
pMPRA1 | Addgene | 49349 | MPRA plasmid backbone |
pMPRAdonor1 | Addgene | 49352 | luc2 ORF donor plasmid |
TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) | Generic | n/a | OLS buffer |
Novex TBE-Urea Gels, 10% | Life Technologies | EC6875BOX | PAGE purification of OLS products |
Novex TBA-Urea Sample Buffer | Life Technologies | LC6876 | PAGE purification of OLS products |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies | S-11494 | PAGE purification of OLS products |
Micellula DNA Emulsion & Purification Kit | EURx/CHIMERx | 3600-01 | Library amplification by emulsion PCR |
Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent | 600675 | Polymerase for emulsion PCR |
SfiI | New England Biolabs | R0123S | Library cloning with pMPRA vectors |
KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | Library cloning with pMPRA vectors |
XbaI | New England Biolabs | R0145S | Library cloning with pMPRA vectors |
T4 DNA Ligase (2,000,000 units/ml) | New England Biolabs | M0202T | Library cloning with pMPRA vectors |
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Life Technologies | C4040-50 | Library cloning with pMPRA vectors |
LB agar and liquid media with carbenicllin | Generic | n/a | Growth media for cloning |
E-Gel EX Gels 1% | Life Technologies | G4010-01 | Library verification and purification |
E-Gel EX Gels, 2% | Life Technologies | G4010-02 | Library verification and purification |
MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Library and backbone purification |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Library DNA isolation |
Cell culture media | n/a | n/a | Experiment-specific |
Transfection reagents | n/a | n/a | Experiment-specific |
MicroPoly(A)Purist Kit | Life Technologies | AM1919 | mRNA isolation |
TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | Plasmid DNA removal |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Life Technologies | 18080-051 | cDNA synthesis |
PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix | Agilent | 600850 | Polymerase for Tag-Seq PCR |
Primers (see text) | IDT | custom | PAGE purify Tag-Seq primers |
References
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유전학 문제 90 유전자 조절 전사 조절 시퀀스 활동 매핑 기자의 분석 도서관 복제 형질 전환 태그 순서 포유 동물 세포Erratum
Formal Correction: Erratum: Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells
Posted by JoVE Editors on 03/01/2015.
Citeable Link.
A correction was made to Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells. There was an error with the last row of Table 1 in the Protocol section. The table row has been corrected to:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGGTGCCTAAAGG
instead of:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG