세대와 인간의 INO80 염색질 리모델링 단지 및 서브 콤플렉스의 정화
Summary
This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.
Abstract
INO80 크로 마틴 리모델링 복합체가 ATP에 의존하는 뉴 클레오 리모델링을 촉매에 의해 뉴 클레오 역학과 DNA의 접근성을 조절한다. 인간의 INO80 단지는 Ino80, 촉매 서브 유닛과 단지의 조립을위한 발판으로 두 역할을하는 SNF2 같은 ATPase를 포함하여 14 단백질 서브 유닛으로 구성되어 있습니다. 다른 서브 유닛의 기능과 그들이 INO80 단지의 크로 마틴 리모델링 활동에 기여하는 메커니즘은 가난으로 인해 인간의 세포 또는 이종 발현 시스템에 INO80 서브 어셈블리를 생성하는 도전에 부분적으로 이해 상태로 유지됩니다. 이 조브 프로토콜은 서브 유닛 또는 서브 유닛의 일부를 부족한 사람 INO80 염색질 리모델링 서브 콤플렉스의 정화를 할 수있는 절차를 설명합니다. N-말단에 FLAG 에피토프는 Ino80 cDNA를 안정적으로 인간 배아 신장 (HEK) FLP – 중재 재조합을 사용하여 293 세포주에 도입 태그. INO80 단지의 서브 유닛의 일부는 b에있는 경우에즉 하나는 해당 서브 유닛의 조립에 필요한 플랫폼이없는 대신 Ino80 돌연변이 단백질을 발현, 삭제. 경우 개별 서브 유닛이 고갈 될 안정적 FLAG을 표현 HEK 293 세포주에이 서브 유닛을 대상으로 한 transfects siRNA를가 Ino80 ATPase의 태그가. 핵 추출물을 준비하고, FLAG의 면역은 Ino80 유도체를 포함하는 단백질 분획을 풍부하게하기 위해 수행된다. 정제 INO80의 서브 콤플렉스의 조성물은 이러한 면역 블로, 실버 염색 및 질량 분석 등의 방법을 사용하여 분석 할 수있다. 이 프로토콜에 따라 생성 및 INO80 INO80 서브 콤플렉스 더욱 정돈 첨부 된 프로토콜에서 설명되는 다양한 생화학 적 분석을 이용하여 분석 될 수있다. 여기에 설명 된 방법은 모든 포유 동물의 멀티 서브 유닛 염색질 리모델링의 구조 및 기능적 특성에 대한 연구 및 수정 단지에 적용 할 수 있습니다.
Introduction
진화 적으로 보존 SNF2 가족 염색질 리모델링 복합체는 염색질 조직 및 DNA 접근성 하나의 주요 레귤레이터이다. 이러한 개조 착체는 항상 어떤 경우에는 다양한 액세서리 단백질과 조립 및 다중 서브 유니트 매크로 분자 어셈블리를 형성하고, 중앙 SNF2 같은 ATPase의 서브 유닛을 포함한다. ATP 의존적 크로 마틴 리모델링 과정의 상세 분자를 연구하기 위해,이 착물의 활동 서브 유닛 및 / 또는 도메인 구조의 주어진 서브 세트의 기여를 이해하는 것이 중요하다. 이러한 분석은 특히 단백질 소단위 또는 도메인 구조 부족 고순도 착체 돌연변이를 생성하는 능력을 요구한다.
ATP 의존적 크로 마틴 리모델링 단지의 이전 구조 기능 연구가 널리 (참고 문헌 1-4, 예를 들어, 참조)으로 인해 효모 게놈의 우수한 조작성에 효모 모델 시스템에 초점을 맞추고있다. 보존을 감안할 때orthologous 리모델링 단지 중 서브 유닛의 구성과 기능, 구조와 효모 리모델링 단지의 기능에 대한 연구는 더 높은 진핵 생물에서 그들의 대응에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 상당한 종 특이 리모델링 단지 사이에 차이가 이득이나 보존 서브 유닛의 보존 영역 내에서 종 특이 서브 유닛, 이득 또는 보존 서브 유닛의 종 – 특정 도메인의 손실 및 시퀀스 다양성의 손실 결과로 존재한다. 이러한 차이는 원칙적으로 높은 진핵 세포가 새로운 분자 세포 환경에 적응하기위한 필요에 의해 구동 될 수있다. 이뿐만 아니라 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다 또한 ATP 의존적 크로 마틴 리모델링 과정의 기본 메커니즘을 조명하고 있지만, 때문에 따라서, 높은 진핵 리모델링 단지의 서브 유닛은 뉴 클레오 리모델링 과정에 기여하는 방법을 이해하는 것은 가치가있는 크로 마틴 구조에 의해 HIG의 유전자 발현그녀의 진핵 세포가 조절된다.
지금까지 단 생화학 적 정의 염색질 리모델링 건물 및 서브 콤플렉스를 얻기에 어려움으로 인해 일부 멀티 서브 유닛 포유 동물의 크로 마틴 리모델링 복합체의 구조 및 기능 연구를,이 제한되고있다. 우리는 부분적으로 면역 정제 안정적으로 N-말단에 FLAG 에피토프가 야생형 또는 Ino80 5-7의 돌연변이 버전 태그 발현 인간 세포에서 손상 INO80 또는 INO80 서브 콤플렉스를 제조하는데 사용되는 후술하는 절차에 이러한 어려움을 회피했다 (도 1) . 인간 세포에서 그대로 INO80 착물을 얻기 위해 중재하는 FLP 재조합 안정적 INO80 착체 8-10의 서브 유닛을 코딩 FLAG 에피토프 태그 된 cDNA를 발현하는 형질 전환 된 HEK293 세포주를 생성하는 데 사용된다. INO80 소단위의 과발현 다소 독성이있을 수 있기 때문에 분리 및 선택적 CO하에 클론 세포주를 유지하는 데 필요nditions 대규모 세포 배양의 확장에 필요한 많은 통로 중에 안정한 유전자의 발현을 확인한다. 서브 유닛의 서브 세트 만 포함 작은 INO80의 서브 콤플렉스를 얻으려면, 우리는 성공적으로이 방법을 사용했다 (그림 2A, B). 첫째, 우리는 안정적으로 특정 서브 유닛 (5)의 상호 작용에 필요한 도메인이 결여 Ino80 버전의 돌연변이를 발현하는 HEK293 FLP 인 세포주를 생성. 또한, siRNA를 매개 최저는 적절한 FLAG-태그 INO80 서브 유닛 (게시되지 않은 데이터)를 발현하는 세포에서 원하는 서브 유닛을 소모하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 인간 INO80 착체를 정화, FLAG 아가 로스 기반 크로마토 11함으로써 효과적으로 정제 INO80 또는 INO80 서브 콤플렉스를 함유하는 최종 분획에 세포질 단백질 오염의 존재를 감소시키는, 핵 추출물에서 INO80 – 함유 분획을 풍부하게하기 위해 사용된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Structural and functional studies of multi-subunit mammalian chromatin remodeling complexes from higher eukaryotes have been hampered by the difficulty of preparing biochemically useful amounts of such complexes containing mutant subunits or lacking certain subunits altogether. There are a number of technical hurdles: First, genetic manipulation in mammalian cells has been technically challenging and time-consuming. Unlike yeast cells, whose genome can be readily edited and targeted using recombineering techniques, the m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the authors' laboratory is supported by a grant from the National Institute of General Medical Sciences (GM41628) and by a grant to the Stowers Institute for Medical Research from the Helen Nelson Medical Research Fund at the Greater Kansas City Community Foundation.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | Company | ||
| Wheaton Dounce Tissue Grinders | Wheaton | 06-435C | |
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 |
References
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