जनरेशन और मानव INO80 Chromatin Remodeling परिसर और Subcomplexes का शोधन
Summary
इस प्रोटोकॉल पैदा करने और जंगली प्रकार और मानव INO80 chromatin remodeling जटिल के उत्परिवर्ती संस्करणों सफ़ाई के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन है. मिलान INO80 सब यूनिटों के संस्करणों stably HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं, और सब यूनिटों के विशिष्ट सेट की कमी पूरी परिसरों और परिसरों क्रोमैटोग्राफी क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध कर रहे हैं चिह्नित.
Abstract
INO80 chromatin remodeling परिसरों एटीपी निर्भर nucleosome remodeling उत्प्रेरित द्वारा nucleosome गतिशीलता और डीएनए अभिगम्यता विनियमित. मानव INO80 परिसरों Ino80, उत्प्रेरक सबयूनिट और परिसरों की विधानसभा के लिए पाड़ के रूप में दोनों में कार्य करता है जो एक SNF2 तरह ATPase, सहित 14 प्रोटीन से मिलकर. अन्य सब यूनिटों के कार्य और वे INO80 परिसर के chromatin remodeling गतिविधि में योगदान तंत्र है जिसके द्वारा खराब होने के कारण मानव कोशिकाओं या heterologous अभिव्यक्ति सिस्टम में INO80 सबअसेंबली पैदा करने की चुनौती के लिए भाग में, समझा रहते हैं. इस जौव प्रोटोकॉल एक सबयूनिट या सब यूनिटों का एक सबसेट कमी कर रहे हैं कि मानव INO80 chromatin remodeling subcomplexes की शुद्धि की अनुमति देता है कि एक प्रक्रिया का वर्णन है. एन टर्मिनली झंडा मिलान Ino80 सीडीएनए stably मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) FLP की मध्यस्थता पुनर्संयोजन का उपयोग कर 293 सेल लाइनों में पेश कर रहे हैं चिह्नित. INO80 परिसर के सब यूनिटों का एक सबसेट ख है कि घटना मेंई एक उन सब यूनिटों की विधानसभा के लिए आवश्यक प्लेटफार्म की कमी है कि बजाय उत्परिवर्ती Ino80 प्रोटीन व्यक्त, नष्ट कर दिया. घटना में एक व्यक्ति सबयूनिट समाप्त किया जा रहा है, stably झंडा व्यक्त एक HEK 293 सेल लाइन में इस सबयूनिट को लक्षित एक transfects siRNAs Ino80 ATPase चिह्नित. परमाणु अर्क तैयार कर रहे हैं, और झंडा immunoprecipitation Ino80 डेरिवेटिव युक्त प्रोटीन अंशों को समृद्ध करने के लिए किया जाता है. शुद्ध INO80 subcomplexes की रचनाओं तो ऐसे immunoblotting, चांदी धुंधला, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री जैसे तरीकों का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के अनुसार उत्पन्न INO80 और INO80 subcomplexes आगे साथ जौव प्रोटोकॉल में वर्णित हैं जो विभिन्न जैव रासायनिक assays, का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है. यहाँ वर्णित विधि किसी भी स्तनधारी बहु सबयूनिट chromatin remodeling के संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों का अध्ययन और संशोधित परिसरों के लिए अनुकूलित किया जा सकता.
Introduction
Evolutionarily संरक्षित SNF2 परिवार chromatin remodeling परिसरों क्रोमेटिन संगठन और डीएनए अभिगम्यता 1 के प्रमुख नियामकों हैं. ये remodeling परिसरों हमेशा कुछ मामलों में, विभिन्न गौण प्रोटीन के साथ assembles और बहु सबयूनिट स्थूल आणविक विधानसभाओं रूपों, जो एक केंद्रीय SNF2 तरह ATPase सबयूनिट, शामिल हैं. एटीपी निर्भर chromatin remodeling प्रक्रिया के आणविक विवरण का अध्ययन करने के लिए, यह परिसरों की गतिविधियों के लिए सब यूनिटों और / या डोमेन संरचनाओं का दिया कैंपेन्स के योगदान को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. इस तरह के विश्लेषण विशेष प्रोटीन या डोमेन संरचनाओं की कमी है कि अत्यधिक शुद्ध उत्परिवर्ती परिसरों उत्पन्न करने की क्षमता की आवश्यकता होती है.
एटीपी निर्भर chromatin remodeling परिसरों का पिछला संरचना समारोह पढ़ाई व्यापक रूप से (refs 1-4, उदाहरण के लिए, देखें) के कारण खमीर जीनोम की बेहतर manipulability लिए खमीर मॉडल प्रणाली पर ध्यान केंद्रित किया है. संरक्षण का दियाorthologous remodeling परिसरों के बीच सबयूनिट संरचना और कार्यक्षमता, संरचना और खमीर remodeling परिसरों के समारोह की पढ़ाई उच्च यूकैर्योसाइटों में अपने समकक्षों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है. बहरहाल, प्रशंसनीय प्रजाति विशिष्ट remodeling परिसरों के बीच मतभेद लाभ या संरक्षित सब यूनिटों के संरक्षित डोमेन के भीतर प्रजातियों विशिष्ट सब यूनिटों, लाभ या संरक्षित सब यूनिटों की प्रजाति विशेष के डोमेन की हानि, और अनुक्रम परिवर्तनशीलता के नुकसान से उत्पन्न, मौजूद है. इस तरह के मतभेदों को सिद्धांत रूप में उच्च यूकेरियोटिक कोशिकाओं नया आणविक और सेलुलर वातावरण के लिए अनुकूल करने के लिए जरूरत के द्वारा संचालित किया जा सकता है. यह न केवल तंत्र में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं भी एटीपी निर्भर chromatin remodeling प्रक्रिया के बुनियादी तंत्र पर प्रकाश डालता है, लेकिन क्योंकि इस प्रकार, उच्च यूकेरियोटिक remodeling परिसरों के सब यूनिटों nucleosome remodeling प्रक्रिया में योगदान कैसे समझ, मूल्यवान है जो chromatin संरचना द्वारा hig में और जीन अभिव्यक्तिउसे यूकैर्योसाइटों विनियमित रहे हैं.
इस प्रकार अब तक, केवल biochemically परिभाषित chromatin remodeling परिसरों और subcomplexes प्राप्त करने में कठिनाइयों की वजह से भाग में बहु सबयूनिट स्तनधारी chromatin remodeling परिसरों की संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन, वहाँ सीमित किया गया है. हम आंशिक रूप से क्रोमैटोग्राफी शुद्धि stably एन टर्मिनली झंडा मिलान जंगली प्रकार या Ino80 5-7 से उत्परिवर्ती संस्करणों में चिह्नित व्यक्त मानव कोशिकाओं से बरकरार INO80 या INO80 subcomplexes तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसमें नीचे वर्णित प्रक्रियाओं के साथ इन कठिनाइयों, circumvented है (चित्रा 1) . मानव कोशिकाओं से बरकरार INO80 परिसरों प्राप्त करने के लिए, FLP की मध्यस्थता पुनर्संयोजन stably INO80 परिसर 8-10 की सब यूनिटों एन्कोडिंग झंडा मिलान चिह्नित cDNAs व्यक्त ट्रांसजेनिक HEK293 सेल लाइनों उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. INO80 सब यूनिटों की अधिक अभिव्यक्ति कुछ हद तक विषाक्त हो सकता है, क्योंकि यह अलग और चयनात्मक सह तहत प्रतिरूप सेल लाइनों को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैnditions बड़े पैमाने पर सेल संस्कृतियों के विस्तार के लिए आवश्यक कई मार्ग दौरान स्थिर transgene अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए. सब यूनिटों में से केवल एक सबसेट होते हैं कि छोटे INO80 subcomplexes प्राप्त करने के लिए, हम सफलतापूर्वक दो दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है (चित्रा 2A, बी). पहले में, हम stably विशिष्ट यूनिटों 5 के साथ बातचीत के लिए आवश्यक डोमेन कमी है Ino80 के उत्परिवर्ती संस्करणों व्यक्त HEK293 FLP में सेल लाइनों उत्पन्न करते हैं. वैकल्पिक रूप से, siRNA मध्यस्थता पछाड़ना एक उपयुक्त झंडा चिह्नित INO80 सबयूनिट (अप्रकाशित डेटा) व्यक्त कोशिकाओं से वांछित सबयूनिट व्यय किया जाता है. अंत में, मानव INO80 परिसरों को शुद्ध करने के लिए फ्लैग agarose आधारित क्रोमैटोग्राफी 11 जिससे प्रभावी रूप से शुद्ध INO80 या INO80 subcomplexes युक्त अंतिम अंश में साइटोसोलिक प्रोटीन contaminating की उपस्थिति को कम करने, परमाणु अर्क से एक INO80 युक्त अंश को समृद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
उच्च यूकैर्योसाइटों से बहु सबयूनिट स्तनधारी chromatin remodeling परिसरों की संरचनात्मक और कार्यात्मक पढ़ाई उत्परिवर्ती सब यूनिटों से युक्त या कुल मिलाकर कुछ यूनिटों की कमी ऐसे परिसरों की biochemically उपयोगी मात्रा मे?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक 'प्रयोगशाला में काम जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान (GM41628) से अनुदान द्वारा और ग्रेटर कैनसस सिटी समुदाय फाउंडेशन में हेलेन नेल्सन मेडिकल रिसर्च फंड से मेडिकल रिसर्च के लिए Stowers संस्थान के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | Company | ||
| Wheaton Dounce Tissue Grinders | Wheaton | 06-435C | |
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 |
References
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