Generation och rening av mänskliga INO80 Chromatin Remodeling Komplex och subcomplexes
Summary
Detta protokoll beskriver ett förfarande för generering och rening av vild typ och muterade versioner av den mänskliga INO80 kromatin remodeling komplex. Epitopmärkt versioner av INO80 subenheter stabilt uttryckt i HEK293-celler, och komplett komplex och komplex som saknar specifika uppsättningar av subenheter renas genom immunoaffinitetskromatografi.
Abstract
INO80 kromatin remodeling komplex reglerar nukleosom dynamik och DNA tillgänglighet genom att katalysera ATP-beroende nukleosomen ombyggnad. Mänskliga INO80 komplex består av 14 proteinsubenheter inklusive Ino80, en SnF2 liknande ATPas, som fungerar både som den katalytiska subenheten och ställningen för montering av komplexen. Funktioner av andra subenheter och de mekanismer genom vilka de bidrar till INO80 komplexets kromatin remodeling aktivitet fortfarande dåligt kända, delvis på grund av utmaningen att generera INO80 underenheter i mänskliga celler eller heterologa expressionssystem. Denna JOVE protokoll beskriver ett förfarande som tillåter rening av mänskliga INO80 kromatin remodeling subcomplexes som saknas en underenhet eller en del av subenheter. N-terminalt FLAG-epitop taggade Ino80 cDNA stabilt införas i humana embryonala njur (HEK) 293-cellinjer med användning av Flp-medierad rekombination. I händelse av att en delmängd av subenheter av INO80 komplex är till be bort, man uttrycker istället muterade Ino80 proteiner som saknar plattformen som behövs för montering av dessa subenheter. I händelse en enskild subenhet är att vara uttömda, ett transfects siRNA riktar denna subenhet i en HEK 293 cellinje som stabilt uttrycker FLAG taggade Ino80 ATPas. Kärnextrakt är beredda, och FLAG immunfällning utförs för att berika proteinfraktioner som innehåller Ino80 derivat. Kompositionerna renade INO80 subcomplexes kan sedan analyseras med användning av metoder såsom immunblotting, silverfärgning, och masspektrometri. De INO80 och INO80 subcomplexes genereras enligt detta protokoll kan vidare analyseras med hjälp av olika biokemiska analyser, som beskrivs i den medföljande JOVE protokollet. De metoder som beskrivs här kan anpassas för studier av de strukturella och funktionella egenskaper hos alla däggdjur multi subenhet kromatin remodeling och modifierande komplex.
Introduction
Evolutionärt bevarade SnF2 familjen kromatin remodeling komplex är viktiga regulatorer av kromatin organisation och DNA tillgänglighet 1. Dessa remodeling komplex innefattar alltid en central SnF2 liknande ATPas subenheten, som i vissa fall, monterar med olika accessoriska proteiner och bildar multi-subenheten makromolekylära aggregat. För att studera de molekylära detaljerna i ATP-beroende kromatin remodeling process är det viktigt att förstå bidragen från givna delmängder av subenheter och / eller domän strukturer för verksamheten i komplexen. Sådana analyser kräver förmågan att generera högt renade muterade komplex som saknar särskilda proteinsubenheter eller domänstrukturer.
Föregående struktur-funktionsstudier av ATP-beroende kromatin remodeling komplex har i stor utsträckning fokuserat på jäst modellsystem på grund av den överlägsna manipulability av jästgenomet (se till exempel ref 1-4). Med tanke på bevarandet avsubenheten sammansättning och funktion bland ortologa remodeling komplex, har studier av struktur och funktion av jäst remodeling komplex gett viktiga insikter i sina motsvarigheter i högre eukaryoter. Ändå existerar märk artspecifika skillnader mellan remodeling komplex, till följd av vinst eller förlust av artspecifika subenheter, vinst eller förlust av arter-specifika domäner av konserverade subenheter och sekvensvariabilitet inom konserverade domäner konserverade subenheter. Sådana skillnader kan i princip drivas av behovet av högre eukaryota celler för att anpassa sig till nya molekylära och cellulära miljöer. Således förstå hur subenheter av högre eukaryota remodeling komplex bidrar till nukleosomen remodelleringsprocessen är värdefull, eftersom det inte bara belyser grundläggande mekanismerna i ATP-beroende kromatin remodeling process, men också kan ge värdefull insikt i de mekanismer genom vilka kromatinstruktur och genuttryck i highennes eukaryoter regleras.
Hittills har det varit endast begränsade strukturella och funktionella studier av multi subenheten däggdjurs kromatin remodeling komplex, delvis beroende på svårigheterna att få biokemiskt definierade kromatin remodeling komplex och subcomplexes. Vi har delvis kringgått dessa svårigheter med de förfaranden som beskrivs nedan, där immunoaffinitetsrening används för att framställa intakta INO80 eller INO80 subcomplexes från mänskliga celler stabilt uttrycker N-terminalt FLAG epitopmärkt vildtyp eller muterade versioner av Ino80 5-7 (figur 1) . För att erhålla intakta INO80 komplex från humana celler, är Flp-medierad rekombination användas för att generera transgena HEK293-cellinjer som stabilt uttrycker FLAG-epitop taggade cDNA som kodar subenheter av INO80 komplex 8-10. Eftersom överuttryck av INO80 subenheterna kan vara något giftig är det nödvändigt att isolera och bibehålla klonala cellinjer vid selektiv conditions att säkerställa stabil transgenexpression under de många passager som behövs för utbyggnaden av storskaliga cellkulturer. För att få mindre INO80 subcomplexes som bara innehåller en delmängd av subenheter har vi framgångsrikt använt två metoder (Figur 2A, B). I det första, vi skapar HEK293 Flp-In cellinjer stabilt uttrycker muterade versioner av Ino80 som saknar domäner som krävs för interaktion med specifika subenheter 5. Alternativt siRNA-medierad knockdown som används för att tömma den önskade subenheten från celler som uttrycker en lämplig FLAG-märkt INO80 subenhet (opublicerade data). Slutligen, för att rena mänskliga INO80 komplex de är FLAG agaros baserad kromatografi 11 används för att berika ett INO80 fraktion från kärnextrakt, vilket gör att den närvaron av förorenande cytosoliska proteiner i slutfraktion innehållande renade INO80 eller INO80 subcomplexes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Strukturella och funktionella studier av multi subenheten däggdjurs kromatin remodeling komplex från högre eukaryoter har hindrats av att det är svårt att förbereda biokemiskt användbara mängder av sådana komplex som innehåller muterade subenheter eller saknar vissa subenheter helt och hållet. Det finns ett antal tekniska hinder: det första har genmanipulation i däggdjursceller varit tekniskt utmanande och tidskrävande. Till skillnad från jästceller, vars genom kan lätt redigeras och målinriktad använ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet i författarnas laboratorium stöds av ett bidrag från National Institute of General Medical Sciences (GM41628) och genom bidrag till Stowers institutet för medicinsk forskning från Helen Nelson Medical Research Fund i Greater Kansas City Community Foundation.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | Company | ||
| Wheaton Dounce Tissue Grinders | Wheaton | 06-435C | |
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 |
References
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).
- Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing. Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).
- Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling. Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Sauer, B. Site-specific recombination: developments and applications. 5 (5), 521-527 (1994).
- Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).
- Cai, Y., et al. YY1 functions with INO80 to activate transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).
- Yao, T., et al. Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex. Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).
- Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques. 16 (4), 730-735 (1994).
- Barker, K. . At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, 207-245 (2005).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei. Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).
