Nanogold وصفها نظام Endosomal خميرة التحليلات التركيبية
Summary
الخميرة، خميرة الخباز كان، كائن نموذج المفتاح لتحديد ودراسة الجينات التي تنظم نشوء حيوي وظائف الجهاز endosomal. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لوضع العلامات المحددة للمقصورات endosomal للدراسات التركيبية.
Abstract
الإندوسومات هي واحدة من كبرى غشاء الفرز نقاط التفتيش في الخلايا حقيقية النواة والتي تنظم إعادة تدوير أو تدمير معظمها من البروتينات الغشاء البلازمي وجولجي. ونتيجة لذلك النظام endosomal يلعب دورا محوريا في الحفاظ على التوازن الخلية، والطفرات في جينات المنتمين إلى هذه الشبكة من العضيات مترابطة بواسطة وسائل النقل الحويصلي، يسبب أمراض خطيرة بما في ذلك السرطان والاضطرابات العصبية. لذا من الأهمية رئيس هو لفهم الآليات الكامنة وراء نشوء حيوي وتنظيم نظام endosomal. كان الخباز الخباز الخميرة محوريا في هذه المهمة. لتسمية تحديدا وتحليل على مستوى التركيبية النظام endosomal هذا النموذج الحي، فإننا نقدم هنا بروتوكول مفصلة لامتصاص nanogold موجبة الشحنة من قبل spheroplasts تليها التصور من هذه الجسيمات من خلال تعزيز التفاعل الفضة. هذا الأسلوب هو أيضا قيمة للغايةل لفحص الصرفي من المسوخ مع عيوب في الاتجار endosomal. وعلاوة على ذلك، فإنه ليس فقط ينطبق على الامتحانات التركيبية لكنها يمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع labelings immunogold للتحقيقات البروتين التعريب.
Introduction
نظام endosomal هو جهاز الفرز غشاء الرئيسية التي تلعب أدوارا متعددة الخلوية حاسمة بما في ذلك الاتجار انزيم الليزوزومية مستقبلات الفرز وإعادة التدوير من غشاء البلازما (بعد الظهر) مستقبلات 1،2. وتنقسم الإندوسومات في ثلاث مقصورات مختلفة، مثال. والإندوسومات في وقت مبكر (EE)، والإندوسومات الراحل (LE) والإندوسومات إعادة التدوير. ويستند هذا التصنيف على الوقت الذي يستغرقه للمواد endocytosed للوصول إليهم، على بروتينات محددة وعلامة على التشكل. يمكن أن تكون إما تسليمها الأغشية، أي البروتين والدهون طبقات ثنائية، المنضوية من PM إلى الجسيمات الحالة عبر الإندوسومات للتدهور أو إعادة تدويرها مرة أخرى. ويتم نقل الأغشية أيضا الإندوسومات من جولجي وبالمثل، إما الاستمرار في الجسيمات الحالة أو يتم استردادها مرة أخرى إلى جولجي. وعلاوة على ذلك، والبروتينات يمكن أن تخزن في الحويصلات اللمعية في مهدها الداخل من endosomal الحد الغشاء، وهي العملية التي تؤدي إلى تشكيلفئة فرعية من جنيه، والهيئات عديد الحويصلات.
نظام endosomal الخميرة هو نسبيا أقل تعقيدا من واحدة من الخلايا حقيقية النواة عالية. وتنقسم الإندوسومات الخميرة في وEE جنيه. وعلى النقيض من خلايا الثدييات أنها لا تحتوي على الإندوسومات إعادة التدوير ولكن أيضا العضيات ذات الصلة يحلول الأنسجة محددة. وبالتالي لديهم شبكة أقل تعقيدا من طرق الاتجار endosomal 3،4. ولذلك فقد الخميرة مثلت ولا تزال تمثل النظام التجريبي مفيد لدراسة بعض المبادئ الأساسية في حركة غشاء نظام endosomal. وأكد هذه الميزة من حقيقة أن العديد من الجينات المعنية في مسارات endosomal تم عزلها في البداية مع شاشات الوراثية في الخميرة 5. في حين أن النظام endosomal الخميرة في النوع البري وخلايا متحولة وقد درس على نطاق واسع باستخدام نهج المجهري البيوكيميائية ومضان، تحقيقاتها على مستوى التركيبية كان فقطالحد الأدنى. التحليلات المورفولوجية هي ذات أهمية خاصة في الخميرة لأن يتم الكشف عن معظم العضيات endosomal عن الهياكل نقط بواسطة المجهر مضان، والتي تجعل من الصعب تحديد لا لبس فيه 6. للأسف سوى عدد محدود من أمصال مضادة الاعتراف علامات البروتين الخميرة endosomal تعمل في المناعية الإلكترون المجهري (IEM) الاستعدادات 7-10. بالنسبة لبعض البروتينات، وقد تم التحايل على هذه المشكلة عن طريق وضع علامات الذاتية من الجينات في المصالح واستخدام الأجسام المضادة الاعتراف علامة على الكشف عن 7،11،12. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، لا يمكن الكشف عنها بواسطة البروتينات هي IEM بسبب انخفاض مستويات التعبير الخاصة بهم. من overexpression ليست حلا لأن هذا النهج يمكن أن تحدث سوء تعريب و / أو تغييرات في التشكل عضية / وظائف. وبالتالي فإن وضع العلامات من مقصورات التقامي مع لجنة التحقيق كشفها بواسطة المجهر الإلكتروني EM هو خيار فعالة. هذا هو الحل الأمثل وخاصة إذا كان العلاقات العامةوسام الإمبراطورية البريطانية تدخل الطريق التقامي بطريقة تعتمد على الوقت، والذي يسمح لمعرفة متى سيكون علامة على عضية محددة 6.
وقد تم بنجاح استخدام امتصاص nanogold موجبة الشحنة من قبل spheroplasts الخميرة (أي. الخميرة حيث تمت إزالة جدار الخلية إنزيمي) لتحديد endosomal الخميرة المقصورات 10. هذه الجسيمات يرتبط بقوة إلى الدهون سالبة الشحنة تتكون الأغشية البيولوجية. وبالتالي الزميلة nanogold موجبة مع رئيس الوزراء، تخترق الخلية عن طريق الإلتقام ويمر عبر EE جنيه وقبل أن يصل إلى فجوة. هذه الجسيمات صغيرة من الذهب، ومع ذلك، لم يكن لديك الحجم المناسب أن ينظر إليها من قبل EM. لجعلها مرئية، حجمها يمكن توسيعها عن طريق التفاعلات الكيميائية التي تؤدي إلى ترسب الفضة أو الذهب حول التحقيق الذهب 13-15. قمنا بتطوير وتطبيق هذا النهج بنجاح IEM على أساس أسلوب Tokuyasu لأداء التحت خلويةيدرس توطين 8،16. يسمح هذا الأسلوب أداء immunogold وضع العلامات على الاستعدادات الخميرة مع قرار ممتاز من التشكل 8،17-24. أنشأنا أيضا إجراء الجمع بين هذا البروتوكول IEM مع وضع العلامات nanogold النظام الخميرة endosomal المقصورات 6. باستخدام هذا النهج الذي اتسمت شكليا فرعية مختلفة من الإندوسومات وultrastructurally فحص المسوخ مع الاتجار endosomal عيب 6،25. علاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن هذا الوسم nanogold يمكن دمجها مع labelings immunogold توفير إمكانية لاستكشاف توزيع بروتين من الفائدة على مجموعات سكانية فرعية مختلفة جسيم داخلي. هنا نقدم كيف يتم تنفيذ وسم النظام الخميرة endosomal مع nanogold موجبة عمليا.
Protocol
Representative Results
Discussion
المناعية الإلكترون المجهري هو الاسلوب الذي يسمح الجمع بين توطين البروتينات مع قرار التركيبية من الناقلين والعضيات حيث تتواجد هذه البروتينات. هذا أمر بالغ الأهمية ولا سيما عند دراسة نظام الخميرة endosomal لأن حجرات لها تظهر هياكل نقط كما في مضان المجهري. وبالتالي فإنه من…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين أشكر رينيه Scriwanek للمساعدة في إعداد الشكل. ويدعم FR بواسطة ECHO (700.59.003)، برنامج ALW المفتوحة (821.02.017 و822.02.014)، والتعاون DFG-NWO (DN82-303) وZonMW VICI (016.130.606) المنح.
Materials
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2.6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 ̊C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 ̊C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc. , Warrington, PA | 216 | store at 4 ̊C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at 4 ̊C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35 º | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100mmx15mm petri dishe | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
References
- Gruenberg, J. The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).
- Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks. Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).
- Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. Lysosomes: fusion and function. Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Meel, E., Klumperman, J. Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system. Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).
- Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).
- Griffith, J., Reggiori, F. Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure. J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).
- Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting. Dev Cell. 3, 271-282 (2002).
- Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 9, 1060-1072 (2008).
- Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway. Traffic. 3, 37-49 (2002).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (3), 847-858 (1998).
- Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells. Traffic. 8, 471-485 (2007).
- Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry. J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).
- Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin. Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).
- Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).
- Cabrera, M., et al. Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering. J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).
- Nair, U., et al. SNARE proteins are required for macroautophagy. Cell. 146, 290-302 (2011).
- Jacquier, N., et al. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Karanasios, E., et al. Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p. Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).
- Mari, M., et al. An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).
- Nair, U., et al. A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis. Autophagy. 8, 780-793 (2012).
- Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).
- Erpapazoglou, Z., et al. A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting. Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).
- Tuinen, E., Riezman, H. Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level. J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Morphology of the yeast endocytic pathway. Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New frontiers in gold labeling. J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).
