超微細構造解析のための酵母エンドソーム系のナノゴールドラベル付け
Summary
酵母、 サッカロマイセス·セレビシエは 、エンドソーム系の生合成と機能を調節する遺伝子を同定し、研究するための重要なモデル生物となっている。ここでは、超微細構造の研究のためのエンドソーム区画の特異的標識のための詳細なプロトコルを提示する。
Abstract
エンドソームは、真核細胞の主要な膜ソートのチェックポイントの一つであり、彼らは主に、細胞膜やゴルジ体からのタンパク質のリサイクルや破壊を調節する。その結果、エンドソーム系は、細胞の恒常性を維持する上で中心的な役割を果たしており、小胞輸送によって相互接続オルガネラのこのネットワークに属する遺伝子の変異は、がんや神経生物学的障害を含む深刻な病状を引き起こす。これは、エンドソーム系の生物発生と組織のメカニズムを理解することは、プライム関連性のある。酵母Saccharomyces cerevisiaeが 、この作業において極めて重要となっている。特にこのモデル生物のエンドソームシステムにラベルを付け、超微細構造レベルで解析するために、我々はここで銀増強反応によりこれらの粒子の可視化に続いてスフェロによって正に帯電したナノ金の取り込みのための詳細なプロトコルを提示する。この方法はあまりにも貴重なものですエンドソーム輸送における欠陥を有する突然変異体の形態学的検査のためのL。また、それのみならず、超微細構造検査のために適用可能であるが、それはまた、タンパク質の局在の調査のための免疫金ラベル付けと組み合わせることができる。
Introduction
エンドソーム系は、1,2受容体リソソーム酵素ソーティング受容体のトラフィッキング及び原形質膜（PM）のリサイクルを含む複数の重要な細胞の役割を果たしている主要な膜選別装置である。エンドソームは、3つの異なるコンパートメント、 すなわち分割されている。初期エンドソーム（EE）、後期エンドソーム（LE）と、リサイクルエンドソーム。この分類は、特定のマーカータンパク質に及び、それらの形態で、それらに到達するためにエンドサイトーシスされた物質のにかかる時間に基づいている。膜は、午後から内部化すなわちタンパク質と脂質二重層は、分解のためにエンドソームを経由してリソソームに送達するか、または再循環する。膜はまた、ゴルジ体からエンドソームに輸送し、同様に、いずれのリソソームに継続するか、戻ってゴルジに検索することがされています。さらに、タンパク質は、エンドソーム境界膜の形成に至る過程から内方出芽管腔小胞に分類することができLEのサブカテゴリ、多胞体。
酵母エンドソーム系は、高い真核細胞のものよりも比較的複雑である。酵母エンドソームは、EEとLEに分かれています。哺乳動物細胞とは対照的に、それらはリサイクルエンドソームでなく、組織特異的なリソソーム関連オルガネラを含まない。そのため彼らは、エンドソーム人身売買ルート3,4の少ない複雑なネットワークを持っている。そのため酵母が表現され、今でもエンドソーム系に膜輸送の基礎となる原則のいくつかを研究するための有利な実験系を表しています。この利点は、エンドソーム経路に関与する多数の遺伝子が最初に酵母5での遺伝子スクリーニングで単離されているという事実によって強調される。 野生型および変異細胞における酵母エンドソーム系は広く生化学的および蛍光顕微鏡法アプローチを用いて研究してきたが、超微細構造レベルでの調査のみであった最小限。エンドソーム小器官のほとんどは彼らの明確な同定6困難に蛍光顕微鏡で断続構造として検出されるため、形態学的分析は、酵母において特に関連する。残念ながら、酵母エンドソームタンパク質マーカーを認識し、抗血清の限られた数は、（IEM）準備7月10日免疫電子顕微鏡で働いている。いくつかのタンパク質については、この問題は、目的の遺伝子の内因性のタグ付けとそれ7,11,12を検出するためのタグを認識する抗体を使用することによって回避されている。多くの場合、しかし、タンパク質が低いため発現レベルのIEMによって検出されない。この方法は細胞小器官の形態/機能にミス局在および/または変更を誘導することができるので、その過剰発現は、解決策ではありません。このように、電子顕微鏡EMによって検出可能なプローブを用いたエンドサイトーシス区画のラベルは、効果的なオプションです。これは、特にPR場合に最適なソリューションです。OBEは、特定の細胞小器官6を迎えます時に知ることができ、時間依存的にエンドサイトーシス経路を、入力している。
酵母スフェロプラスト（細胞壁が酵素的に除去されている、すなわち酵母）によって正に帯電したナノ金の取り込みに成功した酵母エンドソーム区画10は識別するのに使用されている。これらの粒子は強く、生体膜を構成する負に帯電した脂質に結合する。このようにPMと正に帯電したナノゴールドアソシエイツは、エンドサイトーシスによって細胞に浸透し、空胞に到達する前に、EEとLEを通過する。これらの小さな金粒子は、しかしながら、EMによって見られるように適切なサイズを有していない。彼らは目に見えるレンダリングするには、その大きさは、金型プローブ13〜15の周囲に銀や金の析出につながる化学反応によって拡大することができる。我々が開発され、首尾よく実行するために細胞内徳安法に基づくIEMアプローチを適用しているローカリゼーションは、8,16を研究。この方法では、形態学8,17-24の優れた分解能で酵母の準備に免疫金標識化を行うことができます。我々はまた、酵母エンドソーム系コンパートメント6のナノゴールドラベルとこのIEMプロトコルを組み合わせた手順を確立しています。我々は、形態学的に欠陥6,25エンドソーム輸送で変異体をエンドソームの異なるサブクラスを特徴とする超微細構造を調べてきたこのアプローチを使用する。また、我々は、このナノゴールド標識は異なるエンドソーム小集団に、目的のタンパク質の分布を探索する可能性を提供免疫金ラベル付けと組み合わせることができることを実証した。ここでは、正に帯電したナノゴールドと酵母エンドソームシステムの標識は、実質的にどのように実行されるか提示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
免疫電子顕微鏡は、これらのタンパク質が存在するキャリアや細胞小器官の超微細構造の分解能でタンパク質の局在を組み合わせることが可能な技術である。酵母エンドソームシステムを研究する際に、その区画は蛍光顕微鏡のように断続構造が表示されますので、これは特に重大である。これは、それらを区別することは困難である。このような理由から、EMによって検出可能と時間依存?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、図の作成の支援のためにルネScriwanekに感謝します。 FRがエコー（700.59.003）、ALWオープンプログラム（821.02.017や822.02.014）、DFG-NWO協力（DN82-303）とZonMW VICI（016.130.606）の補助金によってサポートされています。
Materials
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2.6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 ̊C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 ̊C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc. , Warrington, PA | 216 | store at 4 ̊C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at 4 ̊C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35 º | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100mmx15mm petri dishe | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
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