Meten Functie Respiratory in Muizen met behulp van Ongebreideld Whole-body plethysmografie
Summary
De beoordeling van respiratoire fysiologie is traditioneel ingeroepen technieken, die beperkingen of sedatie van het dier nodig. Ongebreideld hele lichaam plethysmografie, echter zorgt voor een nauwkeurige, niet-invasieve, kwantitatieve analyse van respiratoire fysiologie in diermodellen. Bovendien kan de techniek herhaalde respiratoire evaluatie van muizen waardoor longitudinale studies.
Abstract
Disfunctie van de luchtwegen is een van de belangrijkste oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in de wereld en de sterfte blijven stijgen. Kwantitatieve beoordeling van de longfunctie in knaagdier modellen is een belangrijk instrument in de ontwikkeling van toekomstige therapieën. Veelgebruikte technieken voor het beoordelen van de respiratoire functie, waaronder invasieve plethysmografie en gedwongen oscillatie. Hoewel deze technieken waardevolle informatie kan gegevensverzameling beladen met voorwerpen en experimentele variabiliteit vanwege de noodzaak voor anesthesie en / of invasieve instrumenten van het dier. Daarentegen ongeremd gehele lichaam plethysmografie (UWBP) biedt een nauwkeurige, niet-invasieve, kwantitatieve wijze waarop parameters respiratoire analyseren. Deze techniek vermijdt het gebruik van anesthesie en beperkingen, die gemeenschappelijk traditionele plethysmografie technieken. Deze video zal de UWBP procedure inclusief de apparatuur instellen, kalibratie en longfunctie opname te tonen. Hetzal uitleggen hoe te analyseren van de verzamelde gegevens, alsmede identificeren experimentele van outliers en artefacten als gevolg van verplaatsingen van dieren. De respiratoire parameters verkregen met deze techniek zijn ademvolume minuut volume, inspiratoire duty cycle, inademingsdebiet en de verhouding van inspiratie tijd tot vervaltijd. UWBP is niet afhankelijk van gespecialiseerde vaardigheden en is goedkoop kunnen worden uitgevoerd. Een belangrijk kenmerk van UWBP en meest tot potentiële gebruikers, is de mogelijkheid om herhaalde metingen van longfunctie voeren op hetzelfde dier.
Introduction
Long disfunctie is een van de belangrijkste oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in de wereld. De aandoening wordt gekenmerkt door onvoldoende zuurstof uitwisseling, synoniem met hoesten, pijn op de borst en kortademigheid. Respiratoire aandoeningen goed voor ~ 10% van de sterfte wereldwijd 1. Volgens de World Health Organization, zijn de sterftecijfers gaan stijgen als gevolg van aanhoudende roken, vervuiling en beroepsmatige irriterende stoffen. UWBP is een nuttige aanvulling voor het bestuderen longfysiologie, die sterk complimenten traditionele biochemische en histologische analyse 2. Andere procedures gebruikt voor long evaluatie niet dezelfde voordelen bieden als UWBP. Invasieve plethysmografie is een veelgebruikte techniek die moet het dier wordt verdoofd 3,4 en wat leidde respiratoire metingen niet altijd weergeven natuurlijke staat. Verder is de eis voor de mechanische ventilatie en chemische uitdagingen beletsel voor toekomstige metingen 3,4.Een andere werkwijze voor het verzamelen van respiratoire gegevens geforceerde oscillatie, die gevoeliger is voor veranderingen in parameters respiratoire fijnere opzichte UWBP 5. Gedwongen trilling is echter een invasieve techniek en vereist dierlijke beëindiging voor gegevensverzameling 5-7.
UWBP betreft het plaatsen van een dier in een gespecialiseerde kamer. Tijdens inspiratie, wordt de getijden lucht opgewarmd en bevochtigd in de longen toenemende waterdamp druk en veroorzaakt thermische uitzetting van gas 8. Dit effect veroorzaakt een netto verandering in de lucht volume creëren van een verhoging van de druk in de plethysmograph kamer 8. Het omgekeerde gebeurt tijdens de uitademing tot een ademhalingsgolfvorm van het dier. Golfvorm analyse wordt vervolgens gebruikt voor het meten van de luchtwegen trace: ademhalingsfrequentie (ademhalingen / min), de totale ademhalingscyclus (sec), inspiratie / expiratie tijd (Ti / Te, s) en veranderingen in druk aan elk slagvolume (P T). <strong> Figuur 1 illustreert elk metingen oorsprong van een respiratoire trace. Deze metingen zijn eenvoudig te berekenen en meerdere parameters ademhalingswegen kan uit deze metingen. Deze parameters zijn onder meer: Tidal volume (de hoeveelheid lucht verplaatst tussen normale inademing en uitademing), minuut volume (volume gas ingeademd uit de longen per minuut), inspiratoire duty cycle (het percentage van de inspiratie tijd om de totale ademhaling cyclusduur) en inademingsdebiet (de hoeveelheid lucht geïnspireerd in een bepaalde tijd).
UWBP levert nauwkeurige, niet-invasieve, kwantitatieve analyse van ademhalingsfysiologie in diermodellen kunnen worden gebruikt voor het meten van de progressie van ademhalingsziekte en longfunctie 6,9. In tegenstelling tot andere technieken plethysmografie, UWBP vermijdt het gebruik van anesthesie, beperkingen en invasieve manipulaties die artefacten en experimentele variabiliteit 6,9 produceren. Anesthesie kan onderdrukken ademhaling,verandert de hartslag en kan een uitdaging zijn om te reguleren 10 zijn. Beperkingen veroorzaken een toename van de ademhaling als gevolg van extra belasting via corticosteron en adrenaline los 11,13. Het belangrijkste kenmerk van UWBP wordt herhaald fysiologische beoordeling waardoor het vatbaar is voor longitudinale studies. UWBP wordt ten zeerste aanbevolen voor de longitudinale beoordeling van longfysiologie en biedt een waardevolle vaardigheid voor de toekomst van de luchtwegen drug evaluatie.
Bleomycine, ovalbumine en hypoxie zijn gebruikt respiratoire problemen veroorzaken in verscheidene studies en UWBP succesvol gemeten accurate long fysiologische beoordeling 7,9,13-16. De beschreven protocol is ontworpen voor standaard volwassen laboratoriummuizen. Echter UWBP aangepast aan andere dieren, zoals ratten, cavia's en primaten 17-20. UWBP beperkt zich niet alleen tot het beoordelen longdisfunctie maar is ook gebruikt voor de beoordeling van longrijping 3.De veelzijdigheid, eenvoud en reproduceerbaarheid van UWBP hebben een uitstekende techniek voor het beoordelen van de longfunctie bij dieren vastgesteld. Diverse software (zie materialen en apparatuur tabel) zal nodig zijn om deze procedure te volgen. Een ervaren wetenschapper zou kunnen dit protocol uitvoeren met een muis binnen 1 uur.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven techniek is een niet-invasieve methode voor het beoordelen van respiratoire parameters ongeremde en niet-verdoofde muizen. De sterke punten van dit protocol zijn onder meer de eenvoud en precisie om de longfunctie te meten in de lengte met minimale artefacten. Er zijn echter een aantal beperkingen en kritische stappen worden opgemerkt over de procedure. Eerst en vooral, dient de muis rust binnen de kamer ten minste vijf seconden verblijven. Extra stress zal het ademhalingspatroon van de muis te verstoren e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Prof David Walker for his technical advice and provision of equipment in the development of this technique. This work is supported by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program. This work was partly supported by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| LabChart 7 software (for Macintosh) | ADINSTRUMENTS | MLU60/7 | used in protocol step 4 |
| PowerLab 8/30 (model ML870) | ADINSTRUMENTS | PL3508 | |
| Octal Bridge Amp (model ML228) | ADINSTRUMENTS | FE228 | |
| Black BNC to BNC cable (1m) | ADINSTRUMENTS | MLAC01 | |
| Macintosh OS | Apple Inc. | – | Mac OS X 10.4 or later |
| Surgipack Digital Rectal Thermometer | Vega Technologies | MT-918 | |
| Grass volumeteric pressure transducer PT5A | Grass Instruments Co. | Model number PT5A; serial No. L302P4. | |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309628 | |
| 5ml serological syringe pipettes | Greiner Bio One | 606160 | Connected via plastic tubing |
| Balance/Scales | VWR International, Pty Ltd | SHIMAUW220D | Any weighing balance with of 0.1 gram resolution |
| HM40 Humidity & temperature meter | Vaisala | HM40A1AB | |
| Barometer | Barometer World | 1586 | |
| Laboratory tubing | Dow Corning | 508-101 | Used to connect water column to the syringe and pressure transducer |
| Cylindrical Perspex Chamber | Dynalab Corp. | Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50mm(w) x 1500mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80mm(l) x 80mm(w). Each lid has a 60mm wide circular hole cut on the face of the lid 50mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25mm in diameter. | |
| 80% Ethanol (4L) | VWR International, Pty Ltd | BDH1162-4LP |
References
- . . World Health Organization, World Health Statistics. , (2008).
- Jones, C. V., et al. M2 macrophage polarization is associated with alveolar formation during postnatal lung development. Respir. Res. 14 (41), 14-41 (2013).
- Campbell, E., et al. Stem cell factor-induced airway hyperreactivity in allergic and normal mice. Am. J. Pathol. 154 (4), 1259-1265 (1999).
- Card, J. W., et al. Cyclooxygenase-2 deficiency exacerbates bleomycin-induced lung dysfunction but not fibrosis. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 37 (3), 300-308 (2007).
- Berndt, A., et al. Comparison of unrestrained plethysmography and forced oscillation for identifying genetic variability of airway responsiveness in inbred mice. Physiol. Genomics. 43 (1), 1-11 (2011).
- Flandre, T., et al. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J. Appl. Physiol. 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Petak, F., et al. Hyperoxia-induced changes in mouse lung mechanics: forced oscillations vs. barometric plethysmography. J. Appl. Physiol. 90 (6), 2221-2230 (2001).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Milton, P. L., Dickinson, H., Jenkin, G., Lim, R. Assessment of respiratory physiology of C57BL/6 mice following bleomycin administration using barometric plethysmography. Respiration. 83 (3), 253-266 (2012).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53 (1), 55-69 (2012).
- Hildebrandt, I., et al. Anesthesia and other considerations for in vivo imaging of small animals. ILAR J. 49 (1), 17-26 (2008).
- Meijer, M. K., et al. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 40, 382-391 (2006).
- Hamelmann, E., et al. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (3), 766-775 (1997).
- Lim, R., et al. Human mesenchymal stem cells reduce lung injury in immunocompromised mice but not in immunocompetent mice. Respiration. 85 (4), 332-341 (2013).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent Bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20, 909-923 (2011).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Wichers, L. B., et al. A method for exposing rodents to resuspended particles using whole-body plethysmography. Part. Fibre Toxicol. 13 (12), (2006).
- Chong, B. T. Y., et al. Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39 (3), 163-168 (1998).
- Lizuka, H., et al. Measurement of respiratory function using whole-body plethysmography in unanesthetized and unrestrained nonhuman primates. J. Toxicol. Sci. 35 (6), 863-870 (2010).
- McGregor, H., et al. The effect of prenatal exposure to carbon monoxide on breathing and growth of the newborn guinea pig. Pediatr. Res. 43, 126-131 (1998).
- Lundblad, L., et al. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Bartlett, D., Tenney, S. M. Control of breathing in experimental anemia. Respir. Physiol. 10 (3), 384-395 (1970).
- Malan, A. Ventilation measured by body plethysmography in hibernating mammals and in poiiulotherms. Respir. Physiol. 17 (1), 32-44 (1973).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respir. Physiol. 129 (3), 297-305 (2002).
- DuBois, A. B., et al. A new method for measuring airway resistance in man using a body plethysmograph: Values in normal subject and in patients with respiratory disease. J. Clin. Invest. 35 (3), 327-335 (1956).
- Enhorning, G., et al. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals. Can. J. Physiol. Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Zhang, Q., et al. Does unrestrained single-chamber plethysmography provide a valid assessment of airway responsiveness in allergic BALB/c mice. Respir. Res. 10 (61), (2009).
