3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares
Summary
In this video protocol we track – at high speed and in three dimensions – fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.
Abstract
O objetivo deste protocolo de vídeo é discutir como executar e analisar uma fluorescente orbital experimento de rastreamento de partículas tridimensional usando uma versão modificada do microscópio de dois fótons 1. Ao contrário de abordagens convencionais (digitalização raster ou campo grande baseado em uma pilha de quadros), o monitoramento orbital 3D permite localizar e seguir com uma alta espacial (precisão nm 10) e resolução temporal (frequência de resposta de 50 Hz) o deslocamento 3D uma partícula fluorescente passar comprimento escalas de centenas de microns 2. O método baseia-se num algoritmo de realimentação que controla o hardware de um de dois fotões microscópio de varrimento laser, a fim de realizar uma órbita circular em torno do objecto a ser rastreado: o mecanismo de realimentação vai manter o objecto fluorescente no centro através do controlo da deslocação da o feixe de varrimento 3-5. Para demonstrar as vantagens desta técnica, seguimos uma organela em movimento rápido, o lisossoma, dentro de alcélula iving 6,7. As células foram semeadas de acordo com protocolos convencionais, e corados com um corante comercialmente lisossoma. Discutimos brevemente a configuração de hardware e de forma mais detalhada o software de controle, para realizar um experimento de monitoramento orbital 3D dentro de células vivas. Discutimos detalhadamente os parâmetros necessários, a fim de controlar o microscópio de varredura e permitir o movimento do feixe em uma órbita fechada em torno da partícula. Conclui-se, demonstrando como esse método pode ser efetivamente usado para rastrear o movimento rápido de um lisossoma marcado ao longo dos microtúbulos em 3D dentro de uma célula viva. Lisossomas podem mover-se com velocidades na gama de 0,4-0,5 um / seg, exibindo tipicamente um movimento dirigido ao longo da rede de microtúbulos 8.
Introduction
Um grande número de abordagens têm sido desenvolvidas até agora para controlar partículas fluorescentes em três dimensões utilizando um microscópio. A maioria das abordagens se baseiam na utilização de câmeras rápidas, ideal para acompanhar em duas dimensões, normalmente combinados com modificações personalizadas da óptica de emissão do microscópio para alcançar rastreamento na direção axial. Microscópios de varredura a laser (ou confocal ou dois fótons) convencionalmente pode acompanhar uma partícula fluorescente através da realização de uma seqüência de tempo de z-stacks, embora este processo é normalmente demorado, e produz resolução de tempo razoável (10 Hz) somente se a partícula ser rastreado é mantida no centro de uma pequena região de imagem raster por um mecanismo de feedback activo 2.
A ideia de bloqueio em que a partícula é a base do método de controle orbital. Em vez de um raster digitalizar uma órbita circular é realizada em torno da partícula fluorescente. A intensidade da fluorescência ao longoa órbita localiza com precisão a posição de partícula 4.
A posição localizada da partícula pode então ser utilizado para accionar os scanners de microscópio e centro-re a órbita na posição de partícula. Os scanners galvanométricos do microscópio são accionados por uma tensão analógica. O componente AC desta voltagem permite realizar uma órbita com o feixe de laser focado, ou seja, um seno e co-seno de onda aplicada aos X e Y digitalização espelhos irá permitir a realização de uma órbita circular. O desvio do sinal de corrente contínua facilita a mudança de posição do centro da órbita. Depois de um período de órbita, é determinada e a forma de onda para o sinal de corrente alternada está configurada, o sistema de realimentação tem de actualizar apenas o componente DC do sinal.
Um software capaz de ler o sinal de fluorescência recolhido dos detectores é necessário para controlar os leitores e detectores, para calcular a posição da partícula e actualizar o CC foradefinido. Para uma reacção de sucesso imagens de uma cuidadosa escolha dos parâmetros da órbita (tamanho e de sincronização) é necessária e estes parâmetros têm de ser ajustadas com base nas características das partículas fluorescentes que é necessário para controlar.
Os fundamentos físicos e matemáticos da técnica foram descritos no passado de 4,5 para ambas as aplicações de 2D e 3D. Neste protocolo, descrevemos resumidamente os principais componentes da configuração de hardware, e em mais detalhe a escolha dos parâmetros e a preparação da amostra necessária para uma experiência típica, permitindo-nos a seguir o deslocamento de um lisossoma em alta resolução temporal dentro de uma célula viva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apesar dos avanços enormes de técnicas de microscopia de fluorescência e instrumentações, nos últimos anos, alcançando trajetórias de partículas fluorescentes em três dimensões com uma resolução temporal alta manteve-se um desafio no campo. Se alta resolução temporal foi alcançado partículas de rastreio em duas dimensões, a extensão no sentido axial tipicamente traz uma drástica redução na resposta de frequência do sistema 10.
Neste protocolo de vídeo, foca…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grants NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 and P50-GM076516
Materials
| Name | Company | Model |
| Lysotracker DND 26 | Life technologies | L-7526 |
| tubuline tracker Green | Life technologies | T34075 |
| Mitotracker RED | Life technologies | M7512 |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | |
| Calcite polarize | Melles Griot Glan | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge technologies | M 6350 |
| Dichroic mirror | Chroma technologies | 700 DCSPXR |
| Motorized stage | ASI | MS2000 |
| Piezo | PI | P721-LLQ |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
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