3D Orbital Tracking i en modifisert to-foton Microscope: en søknad til sporing av intracellulær Blemmer
Summary
In this video protocol we track – at high speed and in three dimensions – fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.
Abstract
Målet med denne videoen protokollen er å diskutere hvordan vi skal utføre og analysere en tredimensjonal fluorescerende orbital partikkel sporing eksperiment ved hjelp av en modifisert to-foton mikroskop en. I motsetning til konvensjonelle tilnærminger (raster scan eller bred felt basert på en stabel med rammer), gjør at 3D-orbital sporing for å lokalisere og følge med en høy romlig (10 nm nøyaktighet) og tidsmessig oppløsning (50 Hz frekvensrespons) 3D-forskyvning av et bevegelig fluorescerende partikkel på lengde-skalaer av hundrevis av mikron to. Fremgangsmåten er basert på en algoritme for tilbakemelding som styrer maskinvaren i en to-foton laser scanning mikroskop for å utføre en sirkulær bane rundt objektet som skal spores: tilbakemeldingsmekanisme vil opprettholde den fluorescerende gjenstand i sentrum ved å styre forskyvningen av skannestrålen 3-5. For å demonstrere fordelene med denne teknikken, etterfulgt vi en rask bevegelse organelle, den lysosome, innen aliving celle 6,7. Celler ble platet i henhold til standard protokoller, og farget ved hjelp av et kommersielt lysosome fargestoff. Vi diskuterer kort på maskinvarekonfigurasjon og mer detaljert styringsprogramvaren, til å utføre en 3D orbital sporing eksperiment i levende celler. Vi diskuterer i detalj de parametere som er nødvendige for å få tak i skanningen mikroskop og muliggjøre bevegelse av strålen i en lukket bane rundt partikkelen. Vi konkluderer ved å demonstrere hvordan denne metoden kan være effektivt brukes til å spore raske bevegelser av en merket lysosome langs mikrotubuli i 3D i en levende celle. Lysosomer kan bevege seg med hastigheter i området fra 0,4 til 0,5 um / sek, typisk viser en rettet bevegelse langs mikrotubuli-nettverket 8..
Introduction
Et stort antall metoder er blitt utviklet til dags dato for å spore fluorescerende partikler i tre dimensjoner ved hjelp av et mikroskop. De fleste metodene er avhengige av bruken av raske kameraer, ideelt egnet for å spore i to dimensjoner, vanligvis kombinert med tilpassede modifikasjoner av strålingsoptikk av mikroskopet for å oppnå relativ i aksial retning. Laser scanning mikroskop (enten konfokale eller to fotoner) som konvensjonelt kan spore en fluoriserende partikkel ved å utføre en tidssekvens av z-stablene, selv om denne prosessen er vanligvis tidskrevende og gir rimelig tid-oppløsning (10 Hz) bare hvis partikkelen er sporet ligger holdt i sentrum av en liten rasterbildedannelse-region av en aktiv tilbakekoblingsmekanisme 2.
Ideen om å låse inn til partikkelen er i bunnen av orbital sporingsmetode. I stedet for et raster skanne en sirkulær bane er utført rundt den fluorescerende partikler. Intensiteten av fluorescensen langsbane nøyaktig lokaliserer partikkel posisjon 4.
Den lokaliserte plasseringen av partikkel kan deretter brukes til å aktivere mikroskop skannere og re-senter bane på partikkel stilling. Galvanometeret skannere av mikroskopet er drevet av en analog spenning. AC-komponenten av denne spenningen gjør det mulig å utføre en bane med en fokusert laserstråle, dvs. en sinus og cosinus bølge påføres på X og Y-avsøkningsspeilene vil tillate å utføre en sirkulær bane. Den DC-forskyvning av signalet muliggjør endring av stillingen av banen senteret. Så snart en bane er bestemt for, og bølgeformen for vekselstrømsignalet er konfigurert, må feedback system for å oppdatere bare DC-komponenten av signalet.
En programvare i stand til å lese det fluorescerende signalet hentet fra detektorene er nødvendig for å kontrollere skannere og detektorene, for å beregne posisjonen til partikkel og oppdatere DC offsatt. For en vellykket tilbake avbildning av et forsiktig valg av baneparametere (størrelse og timing) er påkrevd, og disse parametere må bli justert basert på egenskapene til de fluoriserende partikler som det er nødvendig å spore.
De fysiske og matematiske grunnlaget for teknikken ble beskrevet i det siste 4,5 for både 2D-og 3D-programmer. I denne protokollen beskriver vi kort hovedmaskinvarekomponentene i oppsettet, og i mer detalj på valget av parametrene og prøvepreparering som kreves for et typisk forsøk tillater oss å følge forskyvningen av en lysosome ved en høy tidsmessig oppløsning i en levende celle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Til tross for de enorme utvikler av fluorescens mikroskopi teknikker og besetninger i løpet av de siste årene, oppnå baner av fluorescerende partikler i tre dimensjoner med høy tidsoppløsning har vært en utfordring i feltet. Hvis høy tidsmessig oppløsning er oppnådd sporings partikler i to dimensjoner, forlengelse til den aksiale retning bringer typisk en drastisk reduksjon i frekvensreaksjonen til systemet 10..
I denne video-protokollen fokuserte vi på den demonstrer an…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grants NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 and P50-GM076516
Materials
| Name | Company | Model |
| Lysotracker DND 26 | Life technologies | L-7526 |
| tubuline tracker Green | Life technologies | T34075 |
| Mitotracker RED | Life technologies | M7512 |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | |
| Calcite polarize | Melles Griot Glan | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge technologies | M 6350 |
| Dichroic mirror | Chroma technologies | 700 DCSPXR |
| Motorized stage | ASI | MS2000 |
| Piezo | PI | P721-LLQ |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
- Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
- Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
- Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
- Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
- Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).
- Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
- Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
- Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).
