Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

Summary

In this video protocol we track – at high speed and in three dimensions – fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Abstract

El objetivo de este protocolo de vídeo es discutir cómo realizar y analizar un tridimensional fluorescente orbital experimento de rastreo de partículas usando un microscopio de dos fotones modificado ^1. A diferencia de los enfoques convencionales de exploración de trama (o campo amplio basado en una pila de marcos), el seguimiento orbital 3D permite localizar y seguir con una alta resolución espacial (10 exactitud nm) y la resolución temporal (respuesta de frecuencia 50 Hz) el desplazamiento de 3D una partícula fluorescente pasar longitud escalas de cientos de micras ^2. El método se basa en un algoritmo de realimentación que controla el hardware de una de dos fotones microscopio de barrido láser con el fin de realizar una órbita circular alrededor del objeto a ser rastreados: el mecanismo de retroalimentación mantendrá el objeto fluorescente en el centro mediante el control del desplazamiento de el haz de exploración ^3-5. Para demostrar las ventajas de esta técnica, hemos seguido un orgánulo de movimiento rápido, el lisosoma, dentro de alcelular iving ^6,7. Las células se cultivaron de acuerdo a protocolos estándar, y se tiñeron usando un colorante comercialmente lisosoma. Se discute brevemente la configuración de hardware y con más detalle el software de control, para llevar a cabo un experimento de seguimiento orbital 3D dentro de las células vivas. Se discuten en detalle los parámetros requeridos con el fin de controlar el microscopio de exploración y permitir el movimiento de la viga en una órbita cerrada alrededor de la partícula. Concluimos demostrando cómo este método puede ser usado efectivamente para seguir el movimiento rápido de un lisosoma marcado a lo largo de los microtúbulos en 3D dentro de una célula viva. Los lisosomas pueden moverse con velocidades en el intervalo de 0,4-0,5 m / seg, típicamente presentan un movimiento dirigido a lo largo de la red de microtúbulos ^8.

Introduction

Un gran número de enfoques han sido desarrollados hasta la fecha para realizar un seguimiento de partículas fluorescentes en tres dimensiones usando un microscopio. La mayoría de los enfoques se basan en el uso de cámaras rápidas, ideal para realizar un seguimiento en dos dimensiones, por lo general combinados con modificaciones personalizadas de la óptica de emisión del microscopio para lograr el seguimiento en la dirección axial. Microscopios de barrido láser confocal (ya sea o dos fotones) convencionalmente puede rastrear una partícula fluorescente mediante la realización de una secuencia temporal de z-pilas, aunque este proceso es típicamente mucho tiempo, y produce resolución de tiempo razonable (10 Hz) sólo si la partícula está realizando un seguimiento es mantenido en el centro de una pequeña región de formación de imágenes de trama por un mecanismo de retroalimentación activo ^2.

La idea de quedarse atrapado en la partícula es la base del método de seguimiento orbital. En lugar de una trama escanear una órbita circular que se realiza alrededor de la partícula fluorescente. La intensidad de la fluorescencia a lo largola órbita localiza con precisión la posición de la partícula ^4.

La posición localizada de la partícula puede entonces ser utilizada para accionar los escáneres de microscopio y re-centro de la órbita en la posición de la partícula. Los escáneres galvanómetro del microscopio son impulsados ​​por una tensión analógica. El componente de AC de este voltaje permite realizar una órbita con el haz de láser enfocado, es decir, un seno y una onda de coseno aplicado a los espejos de exploración X e Y permitirá la realización de una órbita circular. El desplazamiento de la señal de DC facilita el cambio de la posición del centro de la órbita. Una vez que un período de órbita y se determina la forma de onda para la señal de CA está configurado, el sistema de retroalimentación necesita actualizar sólo el componente DC de la señal.

Un software capaz de leer la señal fluorescente obtenida de los detectores se requiere para el control de los escáneres y los detectores, para calcular la posición de la partícula y actualizar el DC fueraestablecer. Para una evaluación exitosa imágenes de una cuidadosa selección de los parámetros de órbita (tamaño y calendario) que se requiere y estos parámetros tienen que ser ajustado en base a las características de las partículas fluorescentes que es necesario realizar un seguimiento.

Los fundamentos físicos y matemáticos de la técnica se han descrito en el pasado ^{de 4,5} tanto para aplicaciones 2D y 3D. En este protocolo se describen brevemente los principales componentes de hardware de la configuración, y con más detalle la elección de los parámetros y de la preparación de la muestra necesario para un experimento típico permitiéndonos tras el desplazamiento de un lisosoma en una alta resolución temporal dentro de una célula viva.

Protocol

1. Preparación de muestras Mantener células CHOK1 en matraces de cultivo de tejido utilizando DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y 100 UI / ml de penicilina 50 g / ml de estreptomicina. Se incuban las células en una incubadora humidificado 5% de CO 2 a 37 ° C. Cosecha y luego placa células CHOK1 sobre un diámetro micro-bien 14 mm con un espesor de 0,16 mm superficie. Se siembran las células de la densidad óptima para la imagen, en torno al 60-70% de confluencia. …

Representative Results

De acuerdo con este protocolo de seguimiento de una sola partícula 3D rápido puede llevar a cabo dentro de las células vivas con un microscopio de dos fotones modificado para seguir el desplazamiento de los lisosomas marcados con fluorescencia. El experimento llevado a cabo consiste en el seguimiento de un lisosoma aislado en movimiento dentro de la célula después del proceso de maduración endosoma 9. Los lisosomas se tiñeron utilizando un tinte verde fluorescente y se excita a 930 nm de excitación qu…

Discussion

A pesar de los enormes progresos de las técnicas de microscopía de fluorescencia y instrumentaciones de los últimos años, logrando trayectorias de las partículas fluorescentes en tres dimensiones con una alta resolución temporal se ha mantenido un reto en el campo. Si de alta resolución temporal se ha logrado partículas de rastreo en dos dimensiones, la extensión a la dirección axial típicamente trae una drástica reducción en la respuesta de frecuencia del sistema ^10.

…

Materials

Name	Company	Model
Lysotracker DND 26	Life technologies	L-7526
tubuline tracker Green	Life technologies	T34075
Mitotracker RED	Life technologies	M7512
Coherent Chamelon- ultra II TI	Coherent
Calcite polarize	Melles Griot Glan
Galvanometer-motor mirror	Cambridge technologies	M 6350
Dichroic mirror	Chroma technologies	700 DCSPXR
Motorized stage	ASI	MS2000
Piezo	PI	P721-LLQ
Photomultiplier tube	Hamamatsu	H7422P-40
Data acquisition card	IO tech	PCI 1128-4000
Imaging software	LFD	Global for images-SimFCS