TIRF माइक्रोस्कोपी के माध्यम से एकल घटना के प्रस्ताव पर जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स की क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis Visualizing
Summary
Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.
Abstract
Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.
Introduction
क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis (सीएमई) के प्रक्रिया पुटिकाओं 1-3 में कार्गो इकट्ठा और प्लाज्मा झिल्ली में हेरफेर करने क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytic मशीनरी के कई घटकों की अच्छी तरह से समय आगमन पर निर्भर है. सीएमई endocytosis 1 की नवजात स्थलों पर एक साथ आते हैं कि झिल्ली deforming और कार्गो एडाप्टर प्रोटीन द्वारा शुरू की है. ये प्रोटीन क्लैथ्रिन में लिपटे गड्ढे (सीसीपी) 4 कि रूपों एक पिंजरे की तरह संरचना में assembles जो कोट प्रोटीन क्लैथ्रिन, भर्ती. सीसीपी पूरी तरह से मुख्य रूप से बड़े GTPase, DYNAMIN की कार्रवाई के माध्यम से एक गोलाकार आकृति, झिल्ली बँटवारा, में इकट्ठे होने के बाद, मुक्त क्लैथ्रिन में लिपटे पुटिकाओं (CCVs) 5,6 उत्पन्न करता है. यह internalization घटकों सीएमई के कई दौर के लिए फिर से इस्तेमाल करने की अनुमति, क्लैथ्रिन कोट का तेजी से disassembly हो सके.
सीएमई में शामिल प्रोटीन की खोज और लक्षण वर्णन पारंपरिक bioch में निहित किया गया हैemical, आनुवंशिक, और माइक्रोस्कोपी तकनीक 4-6,8. ये assays इन endocytic घटकों की भूमिकाओं और बातचीत अंक elucidated है. तस्करी मशीनरी की आवश्यक घटकों को परिभाषित करने के लिए बहुत उपयोगी है, इन assays अत्यधिक सीएमई घटकों या कार्गो एकाग्रता के गतिशील व्यवहार पर कब्जा करने में सीमित कर रहे हैं. सीएमई परिभाषित चरणों में प्रोटीन मॉड्यूल के सेट का नृत्य विधानसभा से प्रेरित है, क्योंकि यह एक महत्वपूर्ण सीमा है, और व्यक्तिगत endocytic घटनाओं की गतिशीलता में छोटे परिवर्तन endocytosis पर बड़े संचयी परिणाम हो सकते हैं. इसके अलावा, हाल के डेटा व्यक्ति CCPS इस प्रक्रिया के शारीरिक विनियमन अत्यधिक स्थानिक और अस्थायी 9-14 विवश, सुझाव है कि रचना में और व्यवहार में दोनों अलग हो सकता है कि संकेत मिलता है. व्यक्तिगत endocytic घटनाओं Visualizing, इसलिए, सीएमई में शामिल कई अनावश्यक प्रोटीन और कैसे इन प्रोटीनों से नियंत्रित किया जा सकता है ख कर रहे हैं समझने के लिए क्यों जरूरी हैवाई शारीरिक संकेतों कार्गो internalization को विनियमित करने के लिए.
यहाँ हम जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत CCPS की गतिशीलता के स्तर पर सीएमई का निरीक्षण करने के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) के उपयोग का वर्णन. TIRFM कांच coverslip और कोशिकाओं 15,16 के तरल पदार्थ वातावरण के बीच अपवर्तनांक में अंतर पर निर्भर करता है. उत्तेजना प्रकाश महत्वपूर्ण कोण से अधिक कोशिकाओं की ओर निर्देशित किया जाता है, यह आंतरिक coverslip ऊपर लगभग 100 एनएम का विस्तार रोशनी की एक पतली क्षेत्र का कहना है कि एक क्षणभंगुर लहर पैदा कर देता है. यह इस संकीर्ण क्षेत्र के भीतर ही फ्लोरोसेंट अणुओं उत्साहित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करता है. व्यावहारिक रूप से, इस पर या प्लाज्मा झिल्ली के पास फ्लोरोसेंट अणुओं की उत्तेजना की अनुमति देता है, और सेल के आंतरिक भागों से प्रतिदीप्ति कम करता है. यह प्लाज्मा झिल्ली, सह पर घटनाओं कल्पना करने के लिए एक काफी उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात और जेड अक्ष संकल्प प्रदान करता हैऐसे पारंपरिक epifluorescence या confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में अधिक अधिक इस्तेमाल किया प्रकार mpared. हम भी एक परिचयात्मक और व्यावहारिक स्तर पर, का वर्णन है, आमतौर पर इस्तेमाल किया छवि विश्लेषण मंच के उपयोग का विश्लेषण और सरल रूपात्मक सुविधाओं और व्यक्तिगत कार्गो endocytic घटनाओं की गतिशीलता quantitate लिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम वास्तविक समय में जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत CCPS के स्तर पर क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis (सीएमई) कल्पना करने के लिए TIRFM के उपयोग का वर्णन. सीएमई कई स्थानिक और अस्थायी अलग व्यक्तिगत घटनाओं का संचयी …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. C. Szalinski, H. Teng, and M. Bruchez for help with Imaris, R. Vistein, and D. Shiwarski for technical help and advice, and Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin, and Dr. W Almers for reagents and helpful discussion. Funding provided by T32 grant NS007433 to SLB and NIH DA024698 and DA036086 to MAP.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 millimeter coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
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