Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Lo scopo di questa pubblicazione è quello di visualizzare e discutere le fasi operative di un protocollo Northern Blot avanzata su RNA estratto da Drosophila melanogaster embrioni, cellule e tessuti. Questo protocollo è particolarmente utile per il rilevamento efficiente delle piccole specie di RNA.

Abstract

Gli ultimi decenni hanno visto l'esplosione di interesse scientifico intorno a meccanismi di controllo dell'espressione genica a livello di RNA. Questa branca della biologia molecolare è stato notevolmente alimentata dalla scoperta di RNA non codificanti come principali attori regolazione post-trascrizionale. Tale prospettiva rivoluzionaria è stata accompagnata e innescata dallo sviluppo di tecnologie avanzate per la profilazione dell'espressione RNA breve, sia a livello di high-throughput (identificazione genome-wide) o come l'analisi singolo candidato (accumulo stato stazionario di determinate specie). Anche se diverse strategie state-of-art sono attualmente disponibili per il dosaggio o la visualizzazione di tali molecole in fuga, saggio Northern blot rimane l'approccio ammissibile in biologia molecolare per la valutazione immediata e precisa di espressione dell'RNA. Esso rappresenta un primo passo verso l'applicazione delle più sofisticate tecnologie, costose e, in molti casi, rimane un metodo preferenziale per guadagnare facilmente intuizioniin RNA biologia. Qui PANORAMICA un protocollo efficiente (Enhanced Northern Blot) per rilevare microRNA debolmente espresse (o altre piccole specie di RNA regolatori) da Drosophila melanogaster embrioni interi, sezionato manualmente tessuti / adulti larvali o de cellule coltivate in vitro. È necessaria una quantità molto limitata di RNA e l'uso di materiale dal flusso citometria cellule isolate possono essere anche previsto.

Introduction

RNA biochimica ha sperimentato progressi spettacolari negli ultimi anni ^1. La nostra comprensione del potenziale RNA nel controllo dell'espressione genica è stata scoppiata dall'identificazione dei potenti non codificanti Ribo-regolatori ^2, dalla scoperta di nuovi a base di RNA-meccanismi regolatori ^3,4 e da una caratterizzazione più profonda di eventi post-trascrizionali già noti ^5. Tutti biologia dell'RNA insieme questi studi hanno permesso di rendere drammaticamente la scena, diventando un importante soggetto di ricerca nel panorama scientifico attuale. In particolare, negli ultimi anni stiamo ottenendo un senso di impatto pervasivo del "mondo RNA" in neurobiologia molecolare ^6, uno dei settori di ricerca più dinamiche della moderna scienza della vita. Nell'ultimo decennio del secolo scorso, lo scenario scientifico generale è stata rivoluzionata dalla scoperta del RNA interference ^7,8 e dei piccoli RNA regolatori ^9,10con particolare riguardo alle microRNA ^11, endogenamente espressi piccoli RNA non codificanti implicati nel controllo di quasi tutte le funzioni cellulari come regolatori pleiotropici e combinatorie di espressione genica.

Quasi 10 anni dopo la scoperta iniziale miRNA in Caenorhabditis elegans di Ambros e laboratori di Ruvkun, rinnovata attenzione è stata rivolta al campo quando un alto numero di miRNA sono stati identificati in Drosophila e in cellule umane e ^12-15. Da allora, grazie ad approcci transgenici versatili, Drosophila melanogaster è distinto come un contesto biologico prezioso per approfondire miRNA biosintesi e di attività. Drosophila miRNA hanno rivelato funzioni distinte in processi specifici insetti o evolutivamente conservati, che vanno dall'invecchiamento al metabolismo, vie di segnalazione , il comportamento e, naturalmente, neurogenesi. Lungo questa direzione, abbiamo recentemente presentato un link romanzo ¹⁶ nella co intriganterrelation che si verificano tra il gene maestro GCM / planata e il percorso di RNA. Il fattore di trascrizione mosca Gcm / Glide ^17-19 costituisce un esempio unico del destino delle cellule determinante, che condiziona la scelta destino neuronale gliale vs in multipotenti vola precursori neurali ^20. Venti anni di lunghe ricerche su questo argomento ha chiaramente sottolineato la presenza di molteplici e sovrapposte ingressi di regolazione dell'espressione genica convergenti su gcm / glide ^21-28 per stabilire i livelli di soglia richiesti per bilanciare il delicato rapporto tra controparti neuronali e gliali durante lo sviluppo neurale.

Abbiamo scoperto che la regolamentazione tramite DMEL-miR279 il targeting rappresenta un ulteriore livello di controllo che contribuiscono alla post-trascrizionale messa a punto di GCM / espressione ¹⁶ planare. Globalmente, queste linee di ricerca sono necessari miglioramenti metodologici specifici: lungo anni, diverse tecnologie sviluppate originariamente per analizzare tradRNA transitorie, sono stati convertiti per quantificare piccoli RNA non codificanti, come come saggi di RNase protection, array di cDNA ^29-31, real-time PCR metodi ^32-35 e sequenziamento ^36,37. Dall'altro lato, ricalibrazione degli approcci tecnici ha favorito continui progressi nel campo.

Northern Blot test (NB, o gel RNA blot) costituisce un esempio rappresentativo: è in gran parte utilizzato per il profilo accumulo di RNA, in quanto garantisce sia a livello di espressione quantitativa nonché la determinazione dimensione. Tuttavia, la scarsa sensibilità intrinseca del metodo è limitante quando è applicato a bassa abbondanti espressione genica accordatori, come piccoli RNA. Una conseguenza dannosa è il requisito di grandi quantità di RNA totale, il che rende difficile la sua applicazione a campioni biologici specifici. Per tali ragioni, le varianti NB specifici per il rilevamento di piccoli RNA sono stati sviluppati ^38-40: abbiamo approfittato di una migliore proc NBedure ⁴¹ (ENB, avanzato Blot Nord), mentre chiarire la suddetta interazione tra DMEL-miR279 e GCM / planata.

Questo metodo si basa su un gradino chimica di reticolazione basato sull'attività di un derivato carbodiimmide [1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide, EDC] fissare acido nucleico su supporti solidi. Carbodiimide è un linker croce versatile conosciuta per catalizzare la formazione di legami ammidici tra attivati ​​gruppi carbossilici o fosfato e gruppi amminici ^42. Questa proprietà può essere sfruttata per coppia covalentemente piccoli RNA attraverso il loro gruppo 5'-idrossile mono-amino fosforilata a gruppi sulla superficie delle membrane di nylon. La configurazione risultante attaccamento aumenta l'accessibilità dell'acido nucleico immobilizzato e, a sua volta, l'efficienza di ibridazione sonda-bersaglio, che si traduce in notevole miglioramento rilevamento ^43.

La tecnica assume particolare relevance in studi molecolari Drosophila, dal quale, al verificarsi di nuovi e distintivi classi di piccoli RNA non codificanti sta emergendo ^44. Tra questi, rasiRNAs ^45,46 costituiscono uno specifico sottotipo di RNA-piwi interagenti (piRNAs ^47), coinvolti nella sequenza-specifico silenziamento genico. Dettagli operativi di questo metodo sono descritti e visualizzati in appresso, relative all'analisi del DMEL microRNA-miR279 e DMEL-miR286 e, per la prima volta, di una rasiRNA, rasi4. Abbiamo spinto all'estremo questo metodo, che ci ha permesso rivelare bersagli poco espressi da quantità minime di RNA (meno di 1 mg).

Protocol

1 Raccolta dei campioni Staccare 2 celle semi-aderente di Schneider, (1-5 x 10 6 cellule in media), pipettando e raccolta per centrifugazione (100 xg per 1 min). Nel caso di cellule aderenti coltivate in vitro, li trypsinize in condizioni standard o direttamente raccoglierli da piastre in una conveniente quantità di RNA reagente di estrazione, con l'aiuto di un raschietto cellulare. Per la raccolta degli embrioni, crescere i ceppi di Drosophila in gabbie fly e lasci…

Representative Results

Seguendo la procedura generale descritta nel testo e schematicamente rappresentato in figura 1, abbiamo valutato l'espressione piccoli RNA da campioni di RNA complessi di diversa origine. Nell'esperimento illustrato nella figura 1, l'RNA è stato isolato da di Drosophila Schneider 2 celle di estrazione proteinasi K, controllato per l'integrità (passaggio facoltativo: denaturante di agarosio gel frazionamento) e caricato in doppio. Una metà del gel è stato can…

Discussion

Anche se il nostro apprezzamento per il sofisticato intreccio attraverso il quale l'RNA regola la neurogenesi è in continuo aumento, le implicazioni meccanicistiche di circuiterie di RNA che influenzano neurali biologia delle cellule staminali, differenziamento neuronale / integrazione funzionale, sviluppo di patologie neurali e tumori rimangono inesplorate. Il mantenimento di tali reti attraverso regni rende il potenziale dei sistemi genetici come Drosophila melanogaster strumentale per svelare vie cellul…

Materials

FINAL COMPOSITION/NAME	COMPANY	CATALOGUE (Stock)	COMMENTS
			GENERAL REQUIREMENT
Centrifuge, 5418	Eppendorf	5418 000.017
Decontaminant, RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	Apply on glass/plasticware, wipe and rinse
RNase inhibitor, DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	Hazardous //// 1609-47-8
0.1 % DEPC suspension			Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave
			SAMPLE PREPARATION
Stereo Microscope, M60	Leica
1X PBS Buffer
137 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
2.7 mM KCl	Sigma-Aldrich	P9541	7447-40-7
10 mM Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S3264	7558-79-4
1.8 mM KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	7778-77-0
			RNA EXTRACTION/ANALYSIS
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Gel Imager, ChemiDoc XRS+	Biorad	170-8265
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT	BioRad	170-4487EDU
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent	Life Technologies	15596026	Hazardous
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction	Sigma-Aldrich	77617	136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 for extraction	Sigma-Aldrich	C2432	67-66-3
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing	Sigma-Aldrich	59844	64-17-5
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0311
Stop Mix
300 mM NaOAc, pH 5.5	Sigma-Aldrich	S2889	127-09-3
1x RSB Solution
2% sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	71736	Never cool down SDS to avoid  precipitation //// 151-21-3
2 mg/ml Proteinase K	Roche Applied Science	0-3115828001	EC 3.4.21.64 9
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T5941	1185-53-1
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
30 mM MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	7786-30-3
Denaturing Agarose Gel
1.2% Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2
1x MOPS Buffer			Add when T < 60 ˚C
3% formaldehayde	Sigma-Aldrich	F8775	Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0
10X MOPS Buffer
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7	Sigma-Aldrich	M9381	Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7
Agarose Loading Dye
1x MOPS Buffer
3% formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Hazardous //// 50-00-0
50% formamide	Sigma-Aldrich	47670	Hazardous //// 75-12-7
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml	Sigma-Aldrich	E1510	Hazardous //// 1239-45-8
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9
			SMALL RNA FRACTIONATION
Flat gel loading tips	Life Technologies	LC1002
Savant SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific	DNA120
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell	Biorad	165-8000
Denaturing Acrilamide Gel
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1)	Sigma-Aldrich	A3449	Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer)
7 M urea	Sigma-Aldrich	U6504	57-13-6
0.1% ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	215589	7727-54-0
0.1% TEMED	Sigma-Aldrich	T9281	110-18-9
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step)	Thermo Scientific	SM1211	Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction
Acrylamide Blue Dye
50% formamide	Sigma-Aldrich	47670	Hazardous //// 75-12-7
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9
Running Buffer (RB)
1x MOPS Buffer
Alternative RB: 1x TBE Buffer
1x TBE Buffer
5X TBE
445 mM Tris-base	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
445 mM boric acid	Sigma-Aldrich	B7901	10043-35-3
20 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
Gel Staining Solution
Ethidium bromide 0.5 μg/ml	Sigma-Aldrich	E1510	Hazardous //// 1239-45-8
1x RB			Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr
			BLOTTING
3MM Whatman paper	Sigma-Aldrich	Z270849
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX	GE Healthcare Life Science	RPN203T	Photosensitive
			CROSSLINKING
Crosslinking Solution (XLS)
1% 1-methylimidazole (v/v)	Sigma-Aldrich	336092	Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7
12.5 mM HCl	Sigma-Aldrich	H1758	Hazardous //// 7647-01-0
3.1% EDC (w/v)	Sigma-Aldrich	3450	25952-53-8
			(PRE)-HYBRIDIZATION
Liquid Scintillation Counter	Beckmann	LS 6500
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml	Life Technologies	AM9680
rasi4 antisense probe			5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'
5s-rRNA antisense probe			5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'
Dmel-miR279 antisense probe			5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'
Dmel-miR286 antisense probe			5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns	GE Healthcare Life Science	27-5325-01
(Pre)-Hybridization Solution (HS)
6x SSPE			Pre-warm HS at 37 ˚C before use
0.5% SDS	Sigma-Aldrich	71736	151-21-3
5x Denhardt's Solution
20X SSPE
3.6 M NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
0.2 M sodium phosphate	Sigma-Aldrich	342483	7601-54-9
20 mM EDTA (pH 8.0)	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
50x Denhardt's Solution
1% Ficoll 400 (w/v)	Sigma-Aldrich	F2637	26873-85-8
1% Polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	PVP40	9003-39-8
1% BSA	Sigma-Aldrich	A7906	9048-46-8
1X TEN Buffer
10 mM Tris-Cl (pH 8.0)	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
1 mM EDTA (pH 8.0)	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
Probe Labelling
0.4 μM oligonucleotide
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG002A	Hazardous //// 51963-61-2
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer	Biolabs	B0201
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl	Biolabs	M0201	EC 2.7.1.78
30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA
			WASHING
Geiger Mueller Detectors	Canberra Industries	MCB2/CPS – EM77021
Washing Buffer (WB), 2x SSPE
Stringent Washing Buffers
0.2x SSPE
2x SSPE, 0.5% SDS
0.2x SSPE, 0.5% SDS
			SIGNAL DETECTION
PharosFX Plus System	Biorad	170-9460
Image J	Freely available
Quantity One	Biorad
X-ray films , BioMax XAR	Sigma-Aldrich	F5888	Photosensitive
Developer for X-ray films	Sigma-Aldrich	P7042
Fixer for X-ray films	Sigma-Aldrich	P7167
			STRIPPING
Stripping Solution
10 mM Tris-HCl pH 8.8	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
5 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
0.1% SDS	Sigma-Aldrich	71736	Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3