تحليل Metabolomic من دماغ الفئران بواسطة عالية الدقة النووية الرنين المغناطيسي الطيفي مقتطفات من الأنسجة

Summary

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Abstract

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Introduction

وقد استخدمت نماذج الفئران على نطاق واسع في أبحاث الدماغ ^1. وقد تم التحقيق الارتباط الوراثي، النمط الظاهري في الماوس والفئران العقول من خلال دراسة التعبير الجيني في الحمض النووي الريبي و / أو مستويات البروتين من جهة، والظواهر المورفولوجية والوظيفية، الكهربية و / أو السلوكية على الآخرين ^2-6. ومع ذلك، لنفهم تماما الآليات التي تربط بين النمط الظاهري إلى التركيب الوراثي، لا بد من التحقيق في الأحداث الجزيئية المصب التعبير بروتين، مثال. عملية التمثيل الغذائي للركائز البيوكيميائية التي تعمل على الانزيمات ^7. هذا الشرط أدى، على مدى 10 إلى 15 سنة الماضية، إلى نهضة أبحاث الأيض في العديد من فروع علم الأحياء ^8،9. بينما غالبا ما تركز الدراسات الأيضية الكلاسيكية على تفاصيل مسارات محددة، ويهدف النهج الجديد metabolomic نحو تحقيق شامل للوضع العالمي الأيض الأنسجة قيد النظر.واحد نتيجة لهذا المفهوم هو حاجة واضحة لالأدوات التحليلية التي تقلل من التحيز نحو مسارات و / أو فئات معينة من المركبات الأيضية. ومع ذلك، يستند مقايسة البيوكيميائية الكلاسيكية على تفاعل كيميائي معين من تحليلها محددة التي تحتاج إلى أن تكون محددة قبل إجراء الفحص. على النقيض من ذلك، تعتمد التقنيات الطيفية مثل الرنين المغناطيسي النووي (NMR) مطياف ومطياف الكتلة (MS) (ط) على وجه الخصوص الجزيئية (المادية) الخصائص من المركبات الكيميائية الحيوية، كل منها يؤدي إلى واحد أو عدة إشارات متميزة في الطيف الكشف في سياق تجربة واحدة؛ و (ثانيا) كشف عدد كبير من مركبات مختلفة في التجربة.

وهكذا، كل الطيف يحتوي على معلومات مشتركة من مجموعة كاملة من نواتج الأيض. لهذا السبب، الطرق الطيفية هي الأدوات المناسبة لالايض، كما لا يحتاج إلى اختيار قبل أن تتخذ بشأن طبيعة الحليلة المراد قياسها ⁸ </suع>. ونتيجة لذلك، هذه التقنيات بشكل طبيعي تصلح لدراسات استكشافية لأنها تسهل كثيرا الكشف عن التغيرات الأيضية غير متوقعة.

على الرغم من أن التحليل الطيفي NMR MS ويمكن أن تستخدم بالتبادل لتحليل العديد من نواتج الأيض، كل طريقة يمتلك مزايا وعيوب التي تم استعراضها مؤخرا ¹⁰ محددة. باختصار، يمكن عادة NMR الطيفي أن يؤديها من استخراج النفط الخام و لا يتطلب الفصل الكروماتوغرافي لمركبات العينة قبل التحليل. على النقيض من ذلك، تعمل بالغاز أو MS اللوني السائل (GC أو LC) فصل، باستثناء معينة التطورات الأخيرة مثل التصوير الطيف الكتلي. في بعض الحالات الخاصة مثل تحليل السكريات، قد تصبح فصل LC ضرورة لNMR الطيفي كذلك، لأن خطوط صدى من السكريات المختلفة تتداخل بشكل كبير في بروتون (H ¹⁾ NMR الأطياف. ومع ذلك، ¹ H NMR الطيفي دون مركز حقوق الإنسانيبقى الفصل omatographic الأكثر شعبية، تقريبا التطبيقية عالميا طريقة NMR metabolomic. عموما، وإعداد العينات هو أكثر تستغرق وقتا طويلا ومعقدا لMS مما هو عليه لNMR الطيفي. مشاكل خطيرة بسبب الآثار مصفوفة هي أقل شيوعا بكثير في NMR الطيفي في MS من حيث أنها قد تؤدي إلى إشارات الموهنة كبير. ويمكن تحقيق المستقلب الكميات إما الأسلوب. ومع ذلك، هناك حاجة إلى مركبات متعددة لمعيار MS بسبب الاختلافات في الآثار مصفوفة والكفاءة التأين بين نواتج الأيض. على النقيض من ذلك، هناك حاجة إلى معيار واحد فقط لكل عينة للتحليل الطيفي NMR لأنه في ظل الظروف القياس المناسبة، والأسلوب الأخير هو جوهريا بفضل الكمية لاستجابة NMR الخطية بدقة نواة لوحظ. والعيب الرئيسي هو من NMR لها حساسية منخفضة نسبيا. MS، ولا سيما LC-MS، هو أكثر حساسية من NMR عدة أوامر من حجمها؛ لهذا السبب، MS هو أن يفضل على NMR للتحليل المركبات التي تحدث في تركيزات منخفضة للغاية. من ناحية أخرى، فإن الطبيعة غير تدميري التجربة NMR هي ميزة واضحة على MS. بهذه الطريقة، NMR يمكن القيام بها مرارا وتكرارا على نفس العينة، على سبيل المثال، لمختلف نوى-NMR النشطة مثل ¹ H، الفوسفور-31 ⁽³¹ P)، الكربون 13 (C ^13)، الفلور-19 ⁽¹⁹ F) الخ، كما لا يتم استهلاك المواد بواسطة NMR خلافا لقياسات MS.

كلا NMR وMS يمكن استخدامها في أوضاع مختلفة، كل واحد يجري الأمثل للكشف عن مركبات ذات خصائص كيميائية معينة. على سبيل المثال، ³¹ P NMR غالبا ما يكون أكثر ملاءمة من ¹ H NMR لتحليل المركبات فسفرته بتركيز معتدل، على الرغم من نواتج الأيض تقريبا كل فسفرته تحتوي أيضا على بروتونات. ومع ذلك، قد يكون غامضا من ¹ إشارات H NMR بحلول ¹ H NMR إشارات من المركبات الأخرى، غير فسفرته، في حين أن الأخيرةبالطبع لا تسبب إشارات خلفية في ³¹ P NMR الأطياف. في الوضع التمثيلي، ¹⁹ F تحليل NMR هو أن المفضل للمركبات المفلورة، على سبيل المثال، والمخدرات المفلورة (لا توجد اشارات الخلفية من نواتج الأيض الذاتية)، في حين أن حالة خاصة من ¹³ C NMR ذات أهمية على وجه الحصر تقريبا إذا كان مصير ¹³ ج السلائف الأيضية الخارجية المسمى يحتاج إلى أن يتبع، بسبب وفرة الطبيعية منخفضة للغاية من النظير ¹³ C (حوالي 1٪). العديد من الطيف الجماعية تعمل إما في وضع الأيونات السالبة أو وضع ايون ايجابية. ولذلك، فمن المهم أن نعرف قبل تحليل ما إذا كانت أيونات التي يتعين مراعاتها واتهم سلبا أو إيجابا. نركز هنا على بروتوكول للتحليل metabolome أنسجة المخ بنسبة ¹ H و ³¹ P NMR الطيفي لأن هذا الأسلوب ينتج عدد كبير من تركيزات المستقلب مهمة بتكلفة منخفضة من حيث (ط) الوقت اللازم لإعداد عينة لالثانية (ب) الجهد المطلوب لالمستقلب الكميات. جميع التجارب يمكن القيام بها باستخدام معدات مختبر الكيمياء الرطبة القياسية ومنشأة NMR الطيفي عالية الدقة. يتم وصف متطلبات إضافية في القسم بروتوكول أدناه.

Protocol

ملاحظة: الحيوان الأخلاق بيان وجاءت الدراسات على الحيوانات على الفئران المبادئ التوجيهية صالحة في فرنسا، وتمت الموافقة من قبل اللجنة المحلية الأخلاق (# 40.04، جامعة إيكس مرسيليا مدرسة الطبية، مارسيليا، فرنسا). 1. حصاد وتجميد الدم?…

Representative Results

للحصول على أفضل قرار في أطياف الرنين المغناطيسي للدماغ الأيض ومقتطفات الأنسجة الأخرى، فقد كان منذ فترة طويلة ممارسة شائعة لإزالة أو الأيونات المعدنية قناع (الأهم: أيونات ممغطس) موجودة في استخراج الحلول. وقد تحقق ذلك إما بإضافة عامل خالب مثل EDTA أو CDTA إلى استخراج 19،<…

Discussion

NMR الطيفي هو وسيلة فعالة لقياس تركيزات المركبات الكيميائية في محلول بطريقة استنساخه جدا ودقيقة. ومع ذلك، للحصول على بيانات عالية الجودة من الضروري أن تلتزم قواعد معينة بشأن إعداد العينات وتحليلها. في تحديد تركيزات المستقلب بواسطة الرنين المغناطيسي الطيفي، ولا جيل و…

Materials

Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15-mL, 30-mL tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2-mL tube; should replace "Eppen-dorf" tube if compatible with centrifuge rotor
polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10-mL volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96 % deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96 % deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20 % in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30 % in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Recherche	With tips for volumes from 0.5 to 1000 μL
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be < 70 – 80 % purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913