अस्थिरता परीक्षण के माध्यम से मापा युवा Saccharomyces cerevisiae कोशिकाओं में उत्परिवर्तन दर अलग replicative उम्र की मां की कोशिकाओं के लिए उत्परिवर्तन आवृत्तियों की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. चुंबकीय छंटनी और प्रवाह cytometry तो भविष्यवाणी उत्परिवर्तन आवृत्तियों से किसी भी विचलन की पहचान करने के लिए वास्तविक उत्परिवर्तन आवृत्तियों और मां कोशिकाओं की उम्र को मापने के लिए उपयोग किया जाता है.
Saccharomyces cerevisiae तंत्र और जीनोम अस्थिरता के परिणामों की जांच के लिए एक शानदार मॉडल प्रणाली की गई है. डीएनए की मरम्मत और डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया कारकों अच्छी तरह से विविध प्रजातियों भर में संरक्षित कर रहे हैं के बाद से यह खमीर मॉडल से प्राप्त सूचना, मानव सहित कई जीवों के लिए प्रासंगिक है. हालांकि, एस cerevisiae अभी तक पूरी तरह से है कि क्या बढ़ती उम्र के replicative (mitotic) के साथ म्यूटेशन परिवर्तन जमते की दर की वजह से तकनीकी बाधाओं को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया. उदाहरण के लिए, micromanipulation के माध्यम से खमीर replicative उम्र की माप दुर्लभ उत्परिवर्तन का पता लगाने के निषेध जो कोशिकाओं की बहुत छोटी आबादी, शामिल है. बेटी कोशिकाओं की मौत उत्प्रेरण द्वारा आबादी में मां की कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए जेनेटिक तरीके विकसित किया गया है, लेकिन जनसंख्या आकार अभी भी चयन प्रणाली समझौता है कि यादृच्छिक म्यूटेशनों होते हैं जिसके साथ आवृत्ति द्वारा सीमित हैं. मौजूदा प्रोटोकॉल चुंबकीय sorti का लाभ लेता हैसतह लेबल खमीर माँ कोशिकाओं की एनजी प्ररूपी चयन के माध्यम से दुर्लभ उत्परिवर्तन यों मां कोशिकाओं की उम्र बढ़ने की काफी बड़ी आबादी प्राप्त करने के लिए. अस्थिरता परीक्षण के माध्यम से मापा उत्परिवर्तन दरों,, और उत्परिवर्तन आवृत्तियों पहले युवा कोशिकाओं के लिए स्थापित किया गया और विभिन्न replicative उम्र की मां की कोशिकाओं में उत्परिवर्तन की आवृत्ति की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. उत्परिवर्तन आवृत्तियों तो हल मां की कोशिकाओं के लिए निर्धारित कर रहे हैं, और मां कोशिकाओं की उम्र कोशिका विभाजन के दौरान उनके सेल सतहों पर गठित कली निशान का पता लगाता है कि एक फ्लोरोसेंट अभिकर्मक साथ धुंधला द्वारा प्रवाह cytometry का उपयोग निर्धारित किया जाता है. प्रयोगात्मक एक दिया replicative उम्र की मां की कोशिकाओं के लिए मनाया आवृत्तियों के लिए कोशिका विभाजन की संख्या के आधार पर भविष्यवाणी की उत्परिवर्तन आवृत्तियों की तुलना करें तो जमते म्यूटेशन की दर में उम्र से संबंधित परिवर्तन कर रहे हैं कि क्या की पहचान कर सकते हैं. इस बुनियादी प्रोटोकॉल के बदलाव विशिष्ट जीन कार्यों में परिवर्तन के प्रभाव की जांच के लिए साधन उपलब्ध कराने याउत्परिवर्तन संचय पर विशेष पर्यावरण की स्थिति replicative उम्र बढ़ने के दौरान अंतर्निहित तंत्र जीनोम अस्थिरता को संबोधित करने के लिए.
ऐसे खमीर के रूप में सूक्ष्मजीवों, उत्परिवर्तन दरों की जांच के लिए उत्कृष्ट मॉडल हैं, लेकिन इन मॉडलों को पूरी तरह से कोशिकाओं की mitotic उम्र बढ़ने के दौरान म्यूटेशन के संचय की जांच करने के लिए उपयोग नहीं किया गया है. परमाणु जीनोम में उत्परिवर्तन संचय जीन कार्यों 1 (में या भिन्नता) प्रगतिशील के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप से उम्र बढ़ने के लिए योगदान करने की धारणा रही है. बहुत क्योंकि सतही आनुवंशिक प्रणालियों की इस प्रक्रिया को प्रभावित करने आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों की पहचान और सूक्ष्मजीवों में दुर्लभ प्ररूपी परिवर्तन बढ़ाता की आसानी तेजी लाने सकता उम्र बढ़ने के दौरान तंत्र और उत्परिवर्तन संचय के परिणामों का अध्ययन करने के लिए एक सूक्ष्म प्रणाली का उपयोग करने की क्षमता. डीएनए की मरम्मत कारकों और डीएनए की क्षति प्रतिक्रिया प्रोटीन अच्छी तरह से विविध प्रजातियों 2 भर में संरक्षित कर रहे हैं, और जीवधारी बुढ़ापे में मौलिक समानता एस के रूप में विविध जीवों के लिए पहचान की गई है cerevisiae एकयह संभावना है कि बनाने डी स्तनधारियों 3, खमीर में अध्ययन से प्राप्त परिणामों कई जीवों में उम्र बढ़ने के लिए प्रासंगिक हो जाएगा.
एस में उम्र बढ़ने के अध्ययन cerevisiae कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने या कोशिकाओं के replicative उम्र बढ़ने उपाय है कि दो उम्र बढ़ने के मॉडल का इस्तेमाल करते हैं. कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने की वजह से पोषक तत्व की कमी से 3 एक गैर विभाजित राज्य (स्थिर चरण) में हैं कि खमीर सेल आबादी में व्यवहार्यता के प्रगतिशील नुकसान की विशेषता है. कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने मॉडल बड़े सेल आबादी आसानी से उत्परिवर्ती कोशिकाओं के लिए प्ररूपी चयन करने के लिए इस मॉडल में प्राप्त कर रहे हैं के बाद से म्यूटेशन, 4 साल की उम्र बढ़ाने के साथ जमा दिखाना है कि इस्तेमाल किया गया है. इस मामले में, उत्परिवर्तन संचय विकास संकेत दे रास्ते और oxidative तनाव 5 से प्रभावित हो गया लगता है, और इन कारकों में से प्रत्येक बहुकोशिकीय यूकैर्योसाइटों 3 में उम्र बढ़ने की समझ के लिए प्रासंगिक है. replicative उम्र बढ़ने मॉडल असममित divisi कारनामेएस के बीच पर लगातार सेल पीढ़ियों 3 के साथ होता है कि उम्र बढ़ने की जांच के लिए cerevisiae मां और बेटी की कोशिकाओं. खमीर replicative उम्र बढ़ने अक्सर microfluidic उपकरणों 6,7 में खमीर कोशिकाओं के छोटे आबादी के वीडियो माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मां और बेटी की कोशिकाओं, या अभी हाल ही में की छोटी आबादी के micromanipulation के माध्यम से मापा गया है. सीमित जनसंख्या आकार पूरे जीनोम जानकारी एकल कक्षों से प्राप्त होता है या बहुत ही उच्च आवृत्ति आनुवंशिक परिवर्तन 8 मापा जाता है जब तक कि mitotic उम्र बढ़ने के दौरान उत्परिवर्तन संचय की जांच के लिए इन तरीकों खराब अनुकूल बनाते हैं. एकल कक्षों के पूरे जीनोम अनुक्रमण उत्परिवर्तन संचय की जांच के लिए पर्याप्त डेटा सेट प्रदान करता है, लेकिन प्ररूपी चयन प्रणाली तंत्र अंतर्निहित उत्परिवर्तन संचय का अध्ययन करने के उत्परिवर्तन दर को मापने का एक साधन उपलब्ध कराने के महत्वपूर्ण लाभ है. अध्ययन haploi में प्ररूपी चयन के माध्यम से उत्परिवर्तन आवृत्तियों और दरों की जांच करने के लिएreplicative उम्र बढ़ने के दौरान डी खमीर उपभेदों अभी तक रिपोर्ट नहीं किया गया है.
उत्परिवर्तन दरों सामान्यतः अस्थिरता परीक्षण 9 का उपयोग कर मापा जाता है. उत्परिवर्तन आवृत्ति मूल्यों एक जनसंख्या में एक जीन अनुक्रम में एक उत्परिवर्तन शरण कोशिकाओं की कुल संख्या दर्शाते हैं. यह स्वतंत्र म्यूटेशन होते हैं जिसमें कोशिकाओं और बस पहले से मौजूद म्यूटेशनों वारिस कि उन कोशिकाओं के किसी भी संतान भी शामिल है. इसके विपरीत, अस्थिरता परीक्षण के माध्यम से मापा उत्परिवर्तन दरों नव प्रत्येक कोशिका पीढ़ी के साथ उठता है कि स्वतंत्र म्यूटेशन की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं. इन परीक्षणों को आम तौर पर, एक लक्ष्य अनुक्रम में पहले से मौजूद म्यूटेशनों के साथ कोशिकाओं को जोड़ने के पास संतृप्ति संस्कृतियों बढ़ रही है, और चयनात्मक माध्यम पर विकास द्वारा उत्परिवर्ती कोशिकाओं की पहचान करने की संभावना को कम करने के लिए कम सेल घनत्व में कई दोहराने संस्कृतियों inoculating शामिल है. दोहराने की आबादी में पहचान उत्परिवर्ती कोशिकाओं की संख्या तो मैं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए कई गणितीय मॉडलों में से एक में इस्तेमाल किया जाता हैविकास 9 के दौरान पैदा हुई कि ndependent म्यूटेशन. औसत जनसंख्या आकार के लिए स्वतंत्र म्यूटेशन की संख्या की तुलना उत्परिवर्तन दर का एक उपाय प्रदान करता है. एस में इन जीनों में नुकसान के समारोह म्यूटेशनों चयन phenotypes उत्पादन के बाद से cerevisiae, उत्परिवर्तन आवृत्तियों और दरों अक्सर, URA3 और CAN1 जीन का उपयोग कर मापा जाता है. URA3 द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन एक जहरीले अणु 10 में 5 FOA धर्मान्तरित के बाद URA3 समारोह की हानि, 5 fluoroorotic एसिड (5 FOA) के लिए प्रतिरोधी कोशिकाओं प्रदान करता है. CAN1 द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन कोशिकाओं 11 में arginine और canavanine transports के बाद CAN1 के समारोह की हानि, कोशिकाओं canavanine, एक जहरीले arginine अनुरूप करने के लिए प्रतिरोधी बनने के लिए अनुमति देता है.
दोनों आनुवंशिक और भौतिक छँटाई रणनीतियों को सफलतापूर्वक एस की बड़ी आबादी को प्राप्त करने के लिए नियोजित किया गया है cerevisiae मां कोशिकाओं replicative उम्र बढ़ने के जांच की सुविधा के लिए. जेनेटिक रणनीतियों एक जनसंख्या में बेटी सेल अस्तित्व के खिलाफ चयन कि चालाक दृष्टिकोण शामिल हैं. मां संवर्धन कार्यक्रम (एमईपी) loxP साइटों 12 को शामिल करने के लिए इंजीनियर थे कि दो आवश्यक जीन की बेटी विशिष्ट विघटन के लिए अग्रणी, केवल बेटी कोशिकाओं में Cre recombinase अभिव्यक्ति की बीटा एस्ट्राडियोल प्रेरण शामिल है. एमईपी उपभेदों inducer के अभाव में सामान्य रूप से उगाया जा सकता है, लेकिन केवल माँ कोशिकाओं बेटी कोशिकाओं सेल चक्र 12 के माध्यम से अपनी पहली प्रगति के दौरान आम तौर पर एम चरण में गिरफ्तार करेगी, जबकि प्रेरण निम्नलिखित विभाजित करने के लिए जारी रहेगा. इस प्रणाली को मोटे तौर पर उम्र बढ़ने के दौरान उत्परिवर्तन संचय अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है, यह उम्र बढ़ने माता कोशिकाओं 13,14 में heterozygosity की हानि, द्विगुणित खमीर उपभेदों में जीनोम अस्थिरता का एक अपेक्षाकृत लगातार फार्म, साथ ही जैव रासायनिक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसी तरह, बेटी बन्दी प्रणाली एस की बेटी विशिष्ट अभिव्यक्ति शामिल cereviSIAE URA3 जीन 15. 5 FOA जिस पर URA3 व्यक्त बिंदु बेटी कोशिकाओं मर जाएगा, माध्यम से जोड़ा गया है जब तक माँ कोशिकाओं 15 बढ़ती रहेगी, जबकि बेटी बन्दी उपभेदों, सामान्य रूप से हो जाना. ये मां की कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए उपयोगी व्यवस्था कर रहे हैं, लेकिन वे चयन प्रणाली का गठन कि जीन कार्यों के रखरखाव पर निर्भर करते हैं. चयन प्रणाली की एक या अधिक घटकों में यादृच्छिक म्यूटेशनों चयन बचने के लिए और तेजी से पैदा करना है कि बेटी कोशिकाओं में हो सकता है. एमईपी उपभेदों के विकास के दौरान, उचित जनसंख्या आकार चयन 12 से बच सकता है कि उत्परिवर्ती बेटी कोशिकाओं की उपस्थिति से बचने के लिए निर्धारित किया गया. हालांकि, जनसंख्या के आकार में इस सीमा replicative उम्र बढ़ने के दौरान जीनोम अस्थिरता के दुर्लभ रूपों का पता लगाने समझौता. जनसंख्या के आकार पर यह प्रतिबंध आंशिक रूप से प्रत्येक जीन की दो प्रतियां अधिकांश के बाद से, चयन प्रणाली में योगदान करने के साथ द्विगुणित खमीर उपभेदों का उपयोग करके दूर किया जा सकता हैम्यूटेशन की संभावना 12 हटने का होगा. हालांकि, द्विगुणित उपभेदों का उपयोग आसानी से आसानी से अगुणित खमीर कोशिकाओं में पता लगाया जा सकता है कि उन लोगों की तुलना से पता लगाया जा सकता है कि mutational घटनाओं के प्रकार constrains.
शारीरिक छँटाई रणनीतियों मां कोशिकाओं की बड़ी आबादी के लिए समृद्ध करने के लिए unlabeled बेटी कोशिकाओं से एक लेबल कोशिका की सतह के साथ मां की कोशिकाओं का अलगाव शामिल हैं. एस की कोशिका की सतह प्रोटीन कि अवलोकन (सेल दीवार प्रोटीन) cerevisiae बेटी कोशिकाओं नव वे 16 उपज कि बेटी कोशिकाओं लेबलिंग के बिना मां कोशिकाओं लेबल दोहन किया गया है नवोदित दौरान संश्लेषित कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, बायोटिन के साथ उनकी सतह पर लेबल खमीर कोशिकाओं की एक शुरुआती जनसंख्या उगाया जा सकता है और उसके बाद प्रारंभिक आबादी से उत्पन्न बेटी कोशिकाओं उनकी सतह पर बायोटिन शामिल नहीं होंगे क्योंकि 16 छँटाई विरोधी बायोटिन microbeads और चुंबकीय उपयोग कर अपनी बेटी की कोशिकाओं से अलग . सीरियल विकास औरछंटनी मां कोशिकाओं की उत्तरोत्तर बड़ी आबादी प्राप्त की और विश्लेषण किया जा सकता है. यह प्रक्रिया खमीर 13,14,17,18 के replicative उम्र बढ़ने के दौरान सेल शरीर विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की जांच करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. वर्तमान विधि संभावित दुर्लभ उत्परिवर्तन या प्ररूपी चयन के माध्यम से assayed जीनोम अस्थिरता के अन्य रूपों के संचय को मापने के उद्देश्य के साथ मां की कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए इस बायोटिन लेबलिंग और चुंबकीय छँटाई तकनीक adapts. सीरियल विकास और भौतिक छँटाई उत्तरोत्तर पुराने माँ कोशिकाओं में उत्परिवर्तन संचय का विश्लेषण, साथ ही साथ में उनकी बेटी सेल आबादी अनुमति देते हैं. पीढ़ी प्रति उत्परिवर्तन दरों का निर्धारण एक भविष्यवाणी उत्परिवर्तन आवृत्ति कोशिका विभाजन की एक विशेष नंबर आया है कि मां की कोशिकाओं के लिए गणना करने के लिए अनुमति देता है. भविष्यवाणी की आवृत्ति मूल्यों की वजह से मनाया mutati में कोशिका विभाजन के अतिरिक्त फेरे, पर्याप्त विचलन के लिए वृद्धि की संभावना के आधार पर कर रहे हैंभविष्यवाणी मूल्यों की तुलना आवृत्तियों पर जमते म्यूटेशन की दर में उम्र विशेष परिवर्तन के लिए सबूत प्रदान करते हैं. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, फ्लो द्वारा विश्लेषण के साथ मिलकर मां की कोशिकाओं पर सेल डिवीजनों की साइटों के लिए संगत कली निशान की फ्लोरोसेंट धुंधला जल्दी हल और unsorted आबादी की उम्र वितरण निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ऐसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के रूप में अतिरिक्त फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों,, भी इस प्रोटोकॉल के दौरान उपयोग किया जा सकता है. कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल उम्र बढ़ने से संबंधित जीनोम अस्थिरता को प्रभावित है कि आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल एक मॉडल जीव में उम्र से संबंधित सेल शारीरिक परिवर्तन के लिए सहसंबंध के लिए क्षमता के साथ जीनोम अस्थिरता में उम्र पर निर्भर परिवर्तन के कुशल विश्लेषण में सक्षम बनाता है.
इस प्रोटोकॉल संसाधनों को सक्षम करने के लिए कई तरीकों को जोड़ती है और कुशलता से mitotic सेल उम्र बढ़ने के दौरान जीनोम अस्थिरता का अध्ययन करने के लिए लागू किया जाना cerevisiae मॉडल प्रणाली Saccharomyces में उपलब्ध दृष्टिकोण. Assays के एक व्यापक विविधता प्ररूपी चयन के माध्यम से जीनोम अस्थिरता के विभिन्न रूपों यों म्यूटेशन या गुणसूत्र rearrangements के विशेष रूपों के संचय में संभव उम्र विशेष परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए चुंबकीय छँटाई के साथ जोड़ा जा सकता है. पूरे जीनोम अनुक्रमण दृष्टिकोण उम्र के साथ एक जीनोम में होने वाली परिवर्तन के समग्र प्रकार के बारे में अधिक जानकारी प्रदान कर सकता है, उत्परिवर्तन दर माप प्राप्त करने के लिए प्ररूपी चयन प्रणाली का उपयोग करने के लिए और रियायत के आनुवंशिक परिवर्तन के विशिष्ट प्रकार को अलग करने की क्षमता यंत्रवत अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण लाभ कर रहे हैं उम्र बढ़ने से संबंधित जीनोम अस्थिरता के पहलुओं. सेल उम्र के निर्धारण और संभावित व्यवस्थित बनाने physiologi के समानांतर माप बनाने के लिएप्रवाह के माध्यम से काल परिवर्तन cytometry विशिष्ट उम्र पर्वतमाला के दौरान अन्य सेलुलर परिवर्तन के साथ जीनोम अस्थिरता सहसंबंधी कारगर साधन उपलब्ध कराते हैं. जमते म्यूटेशन की दरों में संभावित उम्र पर निर्भर परिवर्तन के निर्धारण की आवश्यकता है: 1) सावधान युवा सेल आबादी में दरों का निर्धारण करने, सेल उम्र के 2) सही निर्धारण, और 3) मज़बूती reproducibly को मापने के लिए मां कोशिकाओं की पर्याप्त बड़ी आबादी को समृद्ध करने की क्षमता बुढ़ापे में जीनोम अस्थिरता. यह दृष्टिकोण खमीर मॉडल प्रणाली दरों और / या mitotically सक्रिय कोशिकाओं में जीनोम अस्थिरता की आवृत्तियों में उम्र पर निर्भर परिवर्तन के लिए जिम्मेदार अंतर्निहित तंत्र को परिभाषित करने के लिए योगदान करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों तेजी से उम्र पर निर्भर जीनोम अस्थिरता के लिए योगदान के लिए मूल्यांकन किया जा सकता. अंत में, इन अभिलक्षण म्यूटेशन replicative उम्र बढ़ने के दौरान जमा जिस तरीके के लिए खाते में है कि मॉडल का विकास करने के लिए ले जा सकता है.
इस विधि इस तरह की घटनाओं की दर को मापने के लिए चयन phenotypes की उपस्थिति के माध्यम से म्यूटेशन या जीनोम अस्थिरता के अन्य प्रकार का पता लगाने की क्षमता पर निर्भर करता है. हालांकि, परख डिजाइन में रचनात्मकता जीनोम अस्थिरता के कई पहलुओं की जांच किए जाने की अनुमति कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, URA3 और CAN1 जीन परिणामों पर जीनोमिक स्थान से किसी के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए विभिन्न जीनोमिक साइटों पर रखा जा सकता है. कार्यात्मक जीन alleles के लिए विशिष्ट गैर कार्यात्मक जीन alleles के प्रत्यावर्तन विशेष mutational प्रक्रियाओं का परीक्षण कर सकता है. इसके अलावा, एक जीन या दोहराने दृश्यों के साथ एक जीन flanking के कई निष्क्रिय alleles की शुरूआत क्रमशः, बहाली या जीन समारोह के नुकसान के माध्यम से पुनर्संयोजन घटनाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अस्थिरता परीक्षण इन विभिन्न जीनोम अस्थिरता घटनाओं 9 की दरों का निर्धारण करने के लिए मानक दृष्टिकोण हैं. प्रोटोकॉल Muta निर्धारित करने के लिए अच्छी तरह से स्वीकार कर लिया और अपेक्षाकृत सरल घास का मैदान-Coulson मंझला अनुमानक का उपयोग कर लिखा हैtion दर एमएसएस-अधिकतम संभावना अनुमानक विधि उत्परिवर्तन दरों 9 का निर्धारण करने के लिए सबसे अच्छा तरीका माना जाता है, भले ही विविध शोधकर्ताओं के लिए इसे और अधिक सुलभ बनाने के लिए. एमएसएस-अधिकतम संभावना अनुमानक पहले से विस्तार से 9 में समीक्षा की गई है, और एक वैकल्पिक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन और अधिक परिष्कृत गणना की आवश्यकता है. वैकल्पिक रूप से, इस विधि के साथ उत्परिवर्तन दरों की गणना करने के लिए स्वतंत्र सॉफ्टवेयर 22 से उपलब्ध कराया गया है. उत्परिवर्तन दरों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के उपाय प्राप्त करने, पर्याप्त दोहराने संस्कृतियों का उपयोग काफी कम प्रारंभिक सेल घनत्व पर संस्कृतियों inoculating सहित प्रयोगात्मक डिजाइन के कुछ पहलुओं को ध्यान देने की आवश्यकता है कि 10,000 गुना या अधिक, और चुनने उपयुक्त संस्कृति संस्करणों से जनसंख्या का आकार बढ़ता पूरे इतना है कि कोशिकाओं की आबादी चयनात्मक माध्यम पर फैल सकता है. उत्तरार्द्ध बिंदु के लिए, एक पहले से वर्णित सूत्र संस्कृति teste के अंश पर आधारित उत्परिवर्तन दर को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैडी 9. संस्कृतियों के विकास दर में घटबढ़ एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उत्परिवर्तन दर के निर्धारण, और हाल ही में 23 में वर्णित किया गया है इस प्रकार की स्थिति में अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम हो सकता है कि एक संशोधित मंझला आधारित आकलनकर्ता जटिल हो सकता है.
सही रूप में सेल उम्र को मापने की क्षमता पुरानी कोशिकाओं में जीनोम अस्थिरता आवृत्तियों के कारण युवा कोशिकाओं में घटनाओं की दर की उम्मीद मूल्यों से अलग कर रहे हैं कि क्या स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि एक और पहलू है. WGA अलग फ्लोरोसेंट अणुओं को संयुग्मित उपलब्ध है के बाद से हम, पृष्ठभूमि और लचीलेपन के मामले में दोनों, सफेद धुंधला calcofluor के लिए बेहतर होने की WGA धुंधला पाया है. यह लचीलापन फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों के साथ अन्य सेल विशेषताओं का एक साथ माप के लिए और अधिक अवसर प्रदान कर सकते हैं. प्रारंभिक काम तो एक और अधिक करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं संकेत WGA धुंधला के लिए तीव्रता और कोशिकाओं पर कली निशान की इसी संख्या के बीच एक संबंध स्थापित करने के लिएफ्लो के माध्यम से सेल उम्र का तेजी से दृढ़ संकल्प. यह दृष्टिकोण भी आम तौर पर माप के बेहतर reproducibility के लिए माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की जाएगी से बड़ा जनसंख्या आकार के उपयोग की अनुमति देता है. सभी आयु निर्धारण कोशिकाओं के सूक्ष्म परीक्षा के माध्यम से किया जा सकता है, हम दृष्टिकोण प्रवाह cytometry उम्र पर निर्भर जीनोम अस्थिरता को प्रभावित करने वाले कारकों की तेजी से जांच की सुविधा है कि लग रहा है.
मज़बूती से सेल उम्र को मापने के अलावा, ध्यान मां कोशिकाओं बढ़ रही है और कोशिकाओं छँटाई की एक के बाद एक गोल से गुजरना करने के लिए अनुमति दी जाती है कोशिका विभाजन की संख्या को दिए जाने की जरूरत है. कोशिकाओं वांछित सेल घनत्व तक पहुँचने से पहले अधिक सेल डिवीजनों से गुजरना अनुमति दे सकता है एक छोटे प्रारंभिक जनसंख्या आकार या एक बड़ा संस्कृति मात्रा का प्रयोग करें. उदाहरण के लिए, अन्य शोधकर्ताओं कम experime साथ पुरानी कोशिकाओं प्राप्त करने के स्पष्ट लाभ दिया है जो बहुत पुरानी खमीर कोशिकाओं 16, प्राप्त करने के लिए छँटाई के केवल दो दौर का इस्तेमाल किया हैntal कदम. कोशिकाओं छँटाई करने से पहले अधिक कोशिका विभाजन को पूरा करने के लिए अनुमति देने के लिए संस्कृति मात्रा बढ़ाने के लिए है कि क्या विचार कर, मन में एक एकल स्तंभ में कार्रवाई की जा सकती है कि कोशिकाओं की कुल संख्या पर सीमा रखना. एक सेल आबादी सॉर्ट करने के लिए एकाधिक स्तंभों के उपयोग की जरूरत हो सकती है एक बड़ा संस्कृति मात्रा का प्रयोग करें. कोशिकाओं प्रकार / संग्रह अंक के बीच कोशिका विभाजन की कम दौर से गुजरना हैं, तो फिर जीवन काल के दौरान अलग समय बिंदुओं पर उम्मीद की उत्परिवर्तन आवृत्तियों से विचलन निरीक्षण करने के लिए और अधिक अवसर हैं. उदाहरण के लिए, जीवन के दौरान ही में जल्दी नमूने और देर समय बिंदुओं डेटा उत्परिवर्तन आवृत्ति में लगातार वृद्धि का संकेत है, लेकिन जल्दी से और फिर पठारों कि उत्परिवर्तन आवृत्ति बढ़ दिखा सकते हैं जीवन काल के दौरान अतिरिक्त मध्यवर्ती समय पर नमूने उत्पादन हो सकता है. इस प्रोटोकॉल पुराने माँ कोशिकाओं को अलग हालांकि, बाद से, उम्र के साथ उत्परिवर्तन दरों में परिवर्तन का एक और अधिक प्रत्यक्ष उपाय प्राप्त करने के लिए एक अवसर है. अस्थिरता परीक्षण ख सकताई उत्परिवर्तन दर युवा कोशिकाओं का उपयोग कर प्राप्त की दर से अलग होगा या नहीं यह निर्धारित करने के लिए अलग अलग उम्र की मां की कोशिकाओं का उपयोग किया. वे विकास के रूप में इन अस्थिरता परीक्षण के लिए संस्कृतियों पुराने और युवा कोशिकाओं का एक मिश्रण बन जाएँगे, युवा कोशिकाओं के साथ शुरू प्राप्त दरों से किसी भी विचलन एक पुराने शुरुआती जनसंख्या का उपयोग करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है.
reproducibly सही रूप जीनोम अस्थिरता को मापने के लिए वृद्ध मां कोशिकाओं का एक बड़ा पर्याप्त जनसंख्या प्राप्त करने की क्षमता इस दृष्टिकोण की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. प्रोटोकॉल इस उद्देश्य के लिए एक विशेष चुंबकीय छँटाई प्रणाली के उपयोग का वर्णन करता है, जबकि अन्य समूहों वैकल्पिक प्रणालियों 14,18 (सामग्री की तालिका देखें) के साथ खमीर माँ कोशिकाओं को हल किया है. 'निर्माताओं प्रोटोकॉल के कुछ अनुकूलन के लिए आवश्यक हो सकता है, हालांकि इस तरह की वैकल्पिक प्रणाली भी, इस विधि के साथ काम करना चाहिए. भले ही इस्तेमाल किया विशिष्ट प्रणाली की, जनसंख्या आकार की आवश्यकताअध्ययन के लिए चुना उत्परिवर्तन या जीनोम पुनर्व्यवस्था के प्रकार की आवृत्ति के आधार पर डी अलग है. कम से कम, पर्याप्त मां कोशिकाओं एक उत्परिवर्तन आवृत्ति की गणना करने के लिए जनसंख्या के अनुसार कम से कम एक उत्परिवर्ती कॉलोनी प्राप्त करने के लिए होना चाहिए. केवल शून्य से पांच उत्परिवर्ती कालोनियों जनसंख्या आकार, और जनसंख्या के आकार में भी एक छोटे से वृद्धि से उम्मीद कर रहे हैं अगर 5-10 उत्परिवर्ती कालोनियों उम्मीद कर रहे हैं कि, बहुत reproducibility सुधार कर सकते हैं ताकि अभ्यास में, परिणाम काफी चर हो सकता है. बायोटिन एक प्रारंभिक आबादी लेबलिंग, प्रत्येक प्रकार के लिए वसूली दक्षता मां कोशिकाओं में उत्परिवर्तन आवृत्ति को मापने के लिए आवश्यक उचित जनसंख्या आकार की पहचान में मदद करने के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए. प्रत्येक क्रमबद्ध के बाद मां की कोशिकाओं के 90% वसूली के साथ, मूल आबादी का केवल 59% की वृद्धि और छंटनी के पांच दौर के बाद बरामद किया जाएगा. यह ~ 33% की वृद्धि के पांच दौर के बाद मूल आबादी की वसूली और लेबल मां कोशिकाओं का केवल 80% की वसूली कर रहे हैं छँटाई करने के लिए चला जाता हैप्रत्येक क्रमबद्ध दौरान एड. जनसंख्या के आकार में एक दो तीन गुना कमी आसानी से जनसंख्या प्रति उत्परिवर्ती कालोनियों की अविश्वसनीय संख्या को ले जा सकता है, क्योंकि कम आवृत्ति की घटनाओं को मापने जब मापने और वसूली को अधिकतम महत्वपूर्ण है.
पर विस्तार या mitotic सेल उम्र बढ़ने के दौरान जीनोम अस्थिरता का एक व्यापक समझ प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए कई विकल्प हैं. सरल उदाहरण जीन कार्यों, मीडिया परिवर्तन, या अन्य पर्यावरणीय हालत परिवर्तन में परिवर्तन उम्र के साथ परिवर्तन के संचय बदल कैसे विश्लेषण शामिल हैं. बदल जीन समारोह के साथ या उचित हालत में युवा कोशिकाओं के लिए उत्परिवर्तन दरों मापा और नियंत्रण सेल आबादी की तुलना में अलग तरह से दर मूल्यों ने भविष्यवाणी की और से म्यूटेशन अलग ढंग से जमा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. Replicative उम्र बढ़ने के दौरान विभिन्न बिंदुओं पर सेल आबादी ऐसी प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों या डीएनए हानिकारक एजेंटों के रूप में विशिष्ट तनाव, से अवगत कराया जा सकता है. एकoxidative तनाव को क्षणिक और हल्के जोखिम काफी हद तक सेल छँटाई (चित्रा 3) प्रदर्शन करने की क्षमता को बदल नहीं किया था, लेकिन कठोर तनाव कोशिकाओं की वसूली को मुश्किल हो सकती है. प्रारंभिक प्रयोगों मां कोशिकाओं को अभी भी विशिष्ट तनाव के बाद कुशलता से ठीक किया जा सकता है कि सत्यापित करने के लिए आवश्यक होगा. साथ ही, पृथक मां कोशिकाओं के सेलुलर विशेषताओं 3 उम्र बढ़ने के साथ जुड़े रहे हैं कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, mitochondrial और vacuolar आकृति विज्ञान, और अन्य शारीरिक विशेषताओं के स्तर सहित विस्तार से विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अलावा, माता कोशिकाओं एक आगे के इलाज या हेरफेर के लिए एक प्रारंभिक आबादी हो सकता है. मां और बेटी की कोशिकाओं शारीरिक रूप से प्रक्रिया के दौरान अलग हो रहे हैं के बाद से, बेटी कोशिकाओं अभी भी विश्लेषण के लिए उपलब्ध हैं. उदाहरण के लिए, बेटी कोशिकाओं या खमीर मां और बेटी की कोशिकाओं के बीच क्षतिग्रस्त अणुओं की विषम विरासत की शारीरिक विशेषताओं में परिवर्तन <s> 24 उत्परिवर्तन आवृत्तियों / दरों में किसी भी दिलचस्प परिवर्तन के समय की तुलना में हो सकता है ऊपर. बेटी सेल आबादी के लिए उत्परिवर्तन आवृत्तियों भी replicative उम्र बढ़ने के दौरान म्यूटेशन की विषम विरासत है कि क्या वहाँ मॉडल करने के लिए प्रयास करने के क्रम में प्राप्त किया जा सकता है. संक्षेप में, अस्थिरता परीक्षण के साथ छँटाई चुंबकीय सेल के माध्यम से मां की कोशिकाओं के संवर्धन के संयोजन एस के फायदे सक्षम बनाता है cerevisiae मॉडल प्रणाली कुशलतापूर्वक mitotic सेल उम्र बढ़ने के दौरान आनुवंशिक परिवर्तन के संचय के लिए जिम्मेदार तंत्र की जांच करने के लिए लागू किया जाएगा.
The authors have nothing to disclose.
यह काम इस लेख की सामग्री के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचार प्रतिबिंबित नहीं करता PHM को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की उम्र बढ़ने पर राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान R00AG031911 द्वारा समर्थित किया गया था.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | 100mg |
Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | 2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1) |
MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 25 columns suitable for QuadroMACS separator |
QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Separator Only |
QuadroMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads |
BD Falcon Cell Strainer, 40 µm | BD Biosciences | 352340 | 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Powder, filtering after dissolving important to remove particulates |
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 | Life Technologies | W11261 | Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used |
ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | 10 ml, other antifade reagents could also be used |