Cytosole Calcium Metingen in Renal epitheelcellen door flowcytometrie
Summary
Calcium is betrokken bij tal van fysiologische en pathofysiologische signaalwegen. Live cell imaging vereist gespecialiseerde apparatuur en kan tijdrovend zijn. Een snelle, eenvoudige werkwijze met een flow cytometer om relatieve veranderingen in cytosolische calcium in hechtende epitheelcellen gebracht suspensie bepalen geoptimaliseerd.
Abstract
A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.
Introduction
Calcium is een belangrijke tweede messenger verantwoordelijk voor de overdracht van cellulaire fysiologische en pathofysiologische signalen 1. Cytosolische calciumconcentraties worden door de activiteit van calcium pompen en uitwisselaars calcium laag gehouden. De sarcoplasmatisch / endoplasmatisch reticulum calcium ATPase (SERCA) vult het endoplasmatisch reticulum (ER) calcium opslag als onderdeel van een "pomp lek" systeem dat het plasmamembraan calcium ATPase (PMCA) extrudeert calcium aan het extracellulaire compartiment, zowel ATP-afhankelijke manieren 2. Fysiologische boodschappers, zoals hormonen of neurotransmitters, geven hun signalen via G-eiwit gekoppelde receptoren, activering van fosfolipase C, dat fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PIP2) in de plasmamembraan hydrolyseert om diacylglycerol en inositol-trifosfaat (IP3) 3 gegenereerd. Terwijl diacylglycerol blijft in de plasmamembraan, IP3 diffundeert in het cytosol en bindt aan IP3 receptors (IP3R), die ligand geactiveerde calciumkanalen in het ER membraan en calcium vrij uit het ER luminale winkel afgesloten met een toename van cytosolische calciumconcentraties 4. Een alternatieve route voor calcium naar het cytosol te bereiken is door calciumkanalen en warmtewisselaars in de plasmamembraan. Crosstalk tussen deze twee compartimenten zijn beschreven: calcium geïnduceerde calcium vrijstelling (CKP) waar extracellulair calcium induceert calcium vrijlating uit ER winkels 5, en op te slaan bediend calciumentryblokkade (SOCE) waar het legen van de ER-winkels wordt waargenomen door STIM en veroorzaakt opening van Orai calciumkanalen op het plasmamembraan naar hervullen van de ER winkels 6 promoten.
Onder pathofysiologische omstandigheden, de cellulaire calcium respons gedereguleerd en cytosolische calcium verhogingen in afwezigheid van fysiologische stimulatoren 1. De calcium respons kan worden beïnvloed op een aantal manieren langdurige calciumsignaal vertraagd calcium verwijdering uit het cytosol, uitputting van calcium winkels of gelocaliseerde veranderingen in calcium. Bovendien de mitochondriën nemen een centrale rol in buffering en vrijgeven calcium 7. Langdurige en / of supramaximale cytosolische calcium verhoging leidt tot celdood. In feite, calcium meestal niet betrokken bij de cellulaire respons pathofysiologische en is een belangrijke gebeurtenis in een breed scala aan ziekten, zoals neurodegeneratieve ziekte, hartziekte, kanker, botziekte en nierziekten, die voornamelijk worden geassocieerd met celdood en verlies of wijziging van orgaan of weefsel functie 8-10. Bovendien heeft verstoring van calciumsignalen gekoppeld aan cellulaire aanpassing en veranderingen in cellulaire functies en reacties.
Traditioneel worden calcium gemeten signalen met een negatief geladen fluorescente calcium indicator die in cellen is geplaatst in een cel permeabele acetoxymethyl (AM) estervorm. Eenmaal gesplitst door cellulaire esterases, de fluorescente indicatoren blijven binnen het intracellulaire compartiment en de toename in fluorescentie-intensiteit als calcium gebonden. De meest bekende en gebruikte calcium indicator is de ratiometrische Fura-2 ontwikkeld door Roger Tsien en collega 11. Calcium indicatoren met verschillende affiniteiten voor calcium toe verschillende calcium zwembaden worden bewaakt. Detectiemethoden zijn live cell imaging, fluorescentie microplaataflezer en flowcytometrie. De relatief snelle kinetiek van calcium signalen (gewoonlijk binnen enkele seconden tot minuten) maakt beeldvorming van levende cellen de beste werkwijze voor het verkrijgen van de informatie over de kenmerken van de calcium signaal. Naast de snelle kinetiek van calciumsignalen (binnen milliseconden), live cell imaging is een betere methode voor het bestuderen van cellulaire compartimentering van calcium signalering binnen een enkele cel 12. Absolute calciumconcentraties kunnen worden berekend door de minimum en maximum van de fluorescentie calcium indicator door toevoeging van een calcium chelator en permeabiliserende de cellen, respectievelijk, zoals beschreven door Grynkiewicz et al. 11.
Het gebruik van flowcytometrie calcium signalen te meten werd eerst ontwikkeld in de jaren 1980 in immunologische cellen waarin de mogelijkheid vele parameters, zoals membraan integriteit en gescheiden celpopulatie, en het vereiste van cellen in suspensie in combinatie met de ontwikkeling van enkele golflengte meten calcium indicatoren gemaakt flowcytometrie een ideale en convenientdetection methode 13-15. In hechtende cellen beeldvorming van levende cellen verschaft de informatie over calcium signalering, vooral de kinetiek, maar vereist een ingewikkelde installatie omvattende een fluorescentie microscoop, een perfusiesysteem, onderhoud van de cellulaire omgeving, zoals temperatuur, en gespecialiseerde software microscoop voor het verwerven en analyseren van gegevens. Alternatieve methoden zoals fluorescentie microplaat lezer of Pharmacological middel door het gebruik van calciumvangers zijn onvergelijkbaar qua opgedaan informatie. Flowcytometrie wordt op grotere schaal gebruikt cytosolische calcium in hechtende cellen volgen echter in de meeste studies slechts eindpunt metingen worden uitgevoerd. Volgens de methode oorspronkelijk ontwikkeld door Gergely et al. In immunologische B-cellen 16 zijn wijzigingen in cytosolische vrije calciumconcentratie door flowcytometrie met real-time kinetiek en monitoren van de fluorescentie-intensiteit van afzonderlijke cellen uit een monster populatie succes gemeten in kankercellen epitheelcellen en kanker stamcellen hybriden 17. Deze werkwijze werd verder aangepast voor gebruik in hechtende epitheelcellen die moeilijk te beladen met calcium indicatoren 18 zijn.
Hier, met behulp van een onsterfelijk aanhanger epitheliale cellijn afgeleid van de S1-segment van de rat nier proximale tubulus (WKPT-0293 Cl.2) 19 beschrijven we een geoptimaliseerde vereenvoudigd methode voor het meten van veranderingen in cytosolische calciumconcentratie door flowcytometrie. Aangezien veel epitheelcellen een aantal organische transporteurs voor anionische verbindingen bezitten, kan het laden van de cellen met een calcium indicator blijken te zijn een uitdaging. Om de uitstroom van calcium indicatoren, probenecide, de prototypische remmer van organische aniontransporters en oorspronkelijk ontwikkeld om de renale uitscheiding van penicilline 20 afnemen voorkomen, wordt gelijktijdig toegepast in de incubatie medium. De cellen worden gehandhaafd in monolagen op calcium indicator laden gebracht suspensie en calcium signalen direct na toevoeging verbinding gedetecteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Calcium is een belangrijke gebeurtenis in verschillende cellulaire processen als een tweede boodschapper signaalmolecule en ook als een middel voor communicatie tussen de ER en mitochondria. Het vermogen om veranderingen in vrije cytosolische calciumconcentraties meten is een nuttige techniek die kan worden toegepast op alle gebieden van celbiologie. Er zijn verschillende methoden om cytosolische calcium signalen te detecteren. Klassiek, signalen van een ratiometrische calcium indicator, zoals Fura-2, worden bewaakt in …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek in de laboratoria wordt gefinancierd door de Fritz-Bender Foundation, München, Duitsland (TD) en de Universiteit van Witten / Herdecke intern onderzoek subsidie (tot W.-KL). We willen graag Prof Dr. Dr. Frank Thévenod bedanken (Instituut voor Fysiologie, Pathofysiologie en toxicologie, Universiteit van Witten / Herdecke) voor nuttige tips.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Cell permeable |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P-8761 | Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data. | |
| WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line | Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Putney, J. W. Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate. Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).
- Putney, J. W., Ribeiro, C. M. Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores. Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).
- Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. STIM proteins: dynamic calcium signal transducers. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).
- Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. Mitochondrial calcium uptake. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).
- Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences. J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).
- Roderick, H. L., et al. Calcium in the heart: when it’s good, it’s very very good, but when it’s bad, it’s horrid. Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. , (2013).
- Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry. Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).
- June, C. H., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration. Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).
- Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization. Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).
- Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells. Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).
- Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP. Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).
- Woost, P. G., et al. Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats. Kidney Int. 50, 125-134 (1996).
- Beyer, K. H., et al. Benemid,’ p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination. Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).
- Buckley, B. J., Whorton, A. R. Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells. Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).
- Koepsell, H. The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions. Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).
- Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).
- Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes. Cytometry. 17, 343-348 (1994).
- Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis. J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).
- Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells. Mol Cancer. 9, 102 (2010).
- Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood. 74, 2674-2680 (1989).
- Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM. Cytometry. 10, 165-173 (1989).
