Цитозольные Измерения кальция в почечных эпителиальных клеток методом проточной цитометрии

Summary

Кальций участвует в многочисленных физиологических и патофизиологических сигнальных путей. Изображений живых клеток требует специального оборудования и может занять много времени. Быстрый, простой метод с использованием цитометр потока для определения относительных изменений цитозольным кальция в прикрепленных эпителиальных клеток ввели в суспензии оптимизированы.

Abstract

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Introduction

Кальций является важным вторичным мессенджером отвечает за передачу клеточного физиологических и патофизиологических сигналов ^1. Цитозольные концентрации кальция на низком уровне благодаря активности насосов кальция и обменных кальция. Саркоплазматического / эндоплазматический АТФазы ретикулума кальция (SERCA) пополняет эндоплазматической сети (ER) магазин кальция в качестве части системы «утечки насоса" в то время как АТФ-азы плазматической мембраны кальция (PMCA) экструдирует кальция в внеклеточное, как в АТР-зависимых манер ^2. Физиологические мессенджеры, такие как гормоны или нейромедиаторы, передают свои сигналы через G-белками рецепторов, активацию фосфолипазы С, который гидролизует фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (PIP2) в плазматической мембране, чтобы генерировать и диацилглицерол инозитол трифосфата (IP3) ^3. В то время как диацилглицерин остается в плазматической мембране, IP3 диффундирует в цитозоле и связывается с рецептором IP3S (IP3Rs), которые лиганд активированные кальциевые каналы, найденные в ER мембраны и кальций высвобождается из ER просвета магазине кульминацией к увеличению концентрации кальция цитозольных ^4. Альтернативный путь для достижения кальция в цитозоль через кальциевых каналов и теплообменников, присутствующих в плазматической мембране. Перекрестные помехи между этими двумя отсеками были описаны: выпуск кальция индуцированной кальция (CICR), где внеклеточного кальция вызывает высвобождение кальция из ER магазинах ^5, и магазин работает поступления кальция (SOCE), где опорожнения из ER магазинах воспринимается СТИМ и вызывает открытие ORAI кальциевые каналы в плазматической мембране, чтобы способствовать повторным наполнением ER магазинах ^6.

Под патофизиологических условиях, ответ сотовой кальция разрегулирована и цитозольных увеличивается кальция в отсутствие физиологических стимуляторов ^1. Реакция кальция может повлиять на несколькими способами: длительное кальцийСигнал, задерживается удаление кальция из цитоплазмы, истощение магазинах кальция или локализованных изменений в кальция. Кроме того, митохондрии взять на главную роль в буферизации и выпуская кальций ^7. Длительное и / или сверхмаксимальном цитозольный увеличение кальция приводит к гибели клеток. На самом деле, кальция чаще всего не участвует в клеточном патофизиологической ответ и является ключевым событием в широком спектре заболеваний, таких как нейродегенеративные заболевания, болезни сердца, рак, болезни костей и заболевания почек, которые в основном связаны с клеточной смерти и потеря или изменение органа или ткани функции ^8-10. Кроме того, возмущение сигналов кальция было связано с клеточной адаптации и изменений в клеточных функций и реакций.

Традиционно сигналы кальция измеряются с отрицательно заряженной флуоресцентного индикатора кальция, который загружается в клетках в клетки проницаемыми ацетоксиметиловый (AM) форме эфира. После того, как расщепляется клеточными esterasэс, флуоресцентные показатели остаются в пределах внутриклеточное пространство и увеличить интенсивность флуоресценции при кальция связан. Самый известный и используемый показатель кальция является пропорциональный Фура-2 разработана Роджером Tsien и коллег ^11. Показатели кальция с различной аффинностью к кальция позволяют различные бассейны кальция, подлежащих мониторингу. Методы обнаружения включают живых изображений сотовый, флуоресценции планшетного и проточной цитометрии. Относительно быстро кинетика кальциевых сигналов (обычно в течение нескольких секунд до минут) делает живых изображений сотовый наилучший метод для получения наиболее полную информацию о характеристиках сигнала кальция. Помимо быстрой кинетики сигналов кальция (в пределах миллисекунд), изображений живых клеток является лучшим методом изучения клеточного обособления кальциевой сигнализации в пределах одной ячейки ^12. Абсолютные концентрации кальция можно рассчитать путем определения минимального и максимального флуоресценции экз кальцияicator добавлением хелатирующего кальция и permeabilizing клетки, соответственно, как описано Grynkiewicz соавт. ^11.

Использование проточной цитометрии для измерения сигналов кальция была впервые разработана в 1980-х годах в иммунологических клеток, где возможность измерения нескольких параметров, таких как целостности мембраны и разделения популяции клеток, а также требование клеток в суспензии в сочетании с развитием одной длине волны показатели кальция из проточной цитометрии идеального и convenientdetection метода ^13-15. В прикрепленных клеток, изображений живых клеток обеспечивает наиболее полную информацию о кальциевой сигнализации, самое главное кинетики, но требует сложной настройки, содержащий флуоресцентный микроскоп, систему перфузии, поддержание клеточной среды, таких как температура, и специализированное программное обеспечение микроскоп для приобретения и анализа данных. Альтернативные способы, такие как флуоресценция микропланшет-ридера или Pharmacological средства через использование хелаторов кальция несравнимы с точки зрения накопленного информации. Проточной цитометрии становится все более широко используются для контроля цитозольную кальция в прикрепленных клеток, хотя, в большинстве исследований, только конечная точка измерения выполняются. С помощью метода, первоначально разработанный Gergely и др. В иммунологических В-клеток ^16, изменения в цитозольной концентрации свободного кальция с помощью проточной цитометрии с в режиме реального времени и мониторинга кинетики интенсивности флуоресценции в отдельных клеток из популяции образца были успешно измеряется в раковых эпителиальных клеток и стволовых клеток рака гибриды ^17. Этот метод был дополнительно приспособлен для использования в адгезивных эпителиальных клеток, которые трудно загружать с показателями кальция ^18.

Здесь, с помощью клейкого иммортализованной линии эпителиальных клеток, полученной из сегменте S1 крысы проксимальных канальцах почек (WKPT-0293 Cl.2) ^19, опишем оптимизированную упрощенную меню для измерения изменений в цитозольной концентрации кальция методом проточной цитометрии. Поскольку многие эпителиальные клетки обладают рядом органических перевозчиков для анионных соединений, загрузка клеток с индикатором кальция может оказаться сложной задачей. Чтобы предотвратить отток показателей кальция, пробенецидом, прототипом ингибитора органических анионов перевозчиков и первоначально разработанной для уменьшения почечной экскреции пенициллина ^20, применяется одновременно в среде инкубации. Клетки поддерживали в монослоев для индикатора кальция загрузки, приведены в подвески и кальциевых сигналов могут быть обнаружены сразу же после того соединения.

Protocol

1. Подготовка реагентов и решения Подготовка сбалансированный солевой раствор модифицированной Хэнка (HBSS) (в мм: 136,9 NaCl, 5,37 KCl, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCO 3, рН 7,2, нет фенол красный). Хранить при 4 ° С. Сделать 1,5 М CaCl 2 и 2 М 4- (2-гидроксиэтил) -1-пипераз?…

Representative Results

Для увеличения цитозольную кальций, два фармакологические соединения наносили на проксимальных почечных канальцев клеток (WKPT-0293 Cl.2), нагруженных связывания клеток проницаемой кальция красителя, Fluo-3-AM. Образцы необработанных контрольных были загружены кальция связывания красителя в …

Discussion

Кальций является ключевым событием в нескольких клеточных процессов, действующих в качестве второй молекулы посланник сигнализации, а также в качестве средства общения между ЭР и митохондрий. Возможность измерения изменений в свободных цитозольными концентрации кальция является по…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Invitrogen	F-1241	Cell permeable
Probenecid	Sigma-Aldrich	P-8761	Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-062
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
Thapsigargin	Tocris Bioscience	1138
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765
FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software	Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)	Joe Trotter, The Scripps Institute		Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.
WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line			Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH)