In vitro Methylatietest Assay om Protein Arginine methylatie Bestudeer
Summary
Protein arginine methylatie, gekatalyseerd door een klasse van enzymen nl. Proteïne arginine methyl transferase (PRMTs), het proces van enzymatische additie van methylgroep (en) arginines in eiwitten. De in-vitro-methylatie test is de meest betrouwbare instrument voor de beoordeling van de methylatie status van bekende of nieuwe PRMT substraten.
Abstract
Protein arginine methylering is een van de meest voorkomende posttranslationele modificaties in de kern. Protein arginine methylering kan worden geïdentificeerd en / of bepaald via proteomische benaderingswijzen en / of immunoblotting met methyl-arginine specifieke antilichamen. Echter, deze technieken kunnen soms misleidend zijn en bieden vaak vals-positieve resultaten. Het belangrijkste is dat deze technieken geen direct bewijs voor de PRMT substraatspecificiteit. In vitro assays methylatie, anderzijds, bruikbaar biochemische assays die gevoelig zijn en consistent tonen als de geïdentificeerde eiwitten inderdaad PRMT substraten. Een typische in vitro assay omvat methylatie gezuiverde, actieve PRMTs, gezuiverd substraat en een radioisotoop gemerkt methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Hier beschrijven we een stap-voor-stap protocol katalytisch actieve PRMT1, een alomtegenwoordig uitgedrukt PRMT familielid isoleren. Het methyl transferase activiteiten van de gezuiverde PRMT1 werden later getest op Ras GTPase-activerend eiwit bindend eiwit 1 (G3BP1), een bekende PRMT substraat in de aanwezigheid van S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine als methyl donor. Dit protocol kan niet alleen gebruikt voor het vaststellen van de methylatiestatus van nieuwe fysiologische PRMT1 substraten, maar ook voor het begrip van de basismechanismen van proteïne arginine methylatie.
Introduction
Eiwit methylatie werd voor het eerst beschreven in 1968 1. Het was pas de eerste klonen van PRMT1 in 1996, dat de onderzoekers begonnen met het belang van deze post-translationele modificatie 2 waarderen. Interessant is ongeveer 2% van arginine residuen in de eiwitten van nucleaire extracten worden gemethyleerd 3, waarin de overvloed van deze wijziging. Arginine is een positief geladen aminozuur met een basische zijketen stikstof / s in de zijketens van arginine kan post-translationeel gemodificeerd door de toevoeging van een methylgroep, een proces dat arginine methylatie 4-6. Arginine methylatie wordt gekatalyseerd door een klasse van enzymen weten., Eiwit arginine methyl transferases (PRMTs). Arginine kan zowel monomethylated of digemethyleerd en deze kunnen ofwel symmetrisch of asymmetrisch zijn, afhankelijk van het type PRMTs katalyseren de werkwijze 4-6.
Eiwitten die worden weergegeven argininee-glycine rijke motieven zijn potentiële doelwitten voor-PRMT gemedieerde katalyse. PRMT-gemedieerde methylering van substraten is aangetoond dat eiwit-eiwit interacties, eiwit-nucleïnezuur interacties acid, eiwitfunctie, genexpressie en / of cellulaire signalering, die cruciaal zijn voor normale cellulaire homeostase 7-9 moduleren. Om de biologische rol van proteïne arginine methylering begrijpen, zijn nauwkeurige, efficiënte en reproduceerbare assays vereist om de methylatiestatus van de geïdentificeerde PRMT substraten stellen.
In vitro assay methylatie, die de mogelijkheden van gezuiverde PRMTs evalueert methylering van hun substraten katalyseren, is een goed geaccepteerde test voor bestuderen arginine methylering 10-12. Het succes van deze test hangt grotendeels af van de activiteit van het gezuiverde PRMTs. PRMTs kan worden uitgedrukt en gezuiverd uit bacteriën of zoogdiercellen 10,11. Dit in vitro assay methylatie, als dm gedetailleerde in het protocol is gebaseerd op een werkwijze die oorspronkelijk beschreven door Tini en collega 10. In dit protocol, laten we in detail de stappen die betrokken zijn bij de expressie en zuivering van PRMT1 in zoogdiercellen. Het vermogen van de gezuiverde PRMT1 methylering van Ras GTPase-activerend eiwit katalyseren bindend eiwit 1 (G3BP1), een bekende PRMT substraat 8, werd later onderzocht in aanwezigheid van S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine als methyl donor. Met deze assay kunnen we betrouwbaar de mogelijkheden van de PRMTs definiëren methylaat nieuwe of bekende substraten, die een eerste stap in de studie van proteïne arginine methylatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierin beschreven protocol wordt routinematig gebruikt om de methylatiestatus van de geïdentificeerde PRMT substraten stellen. Deze robuuste en consistente analyse zal ook de definitieve gegevens over de specificiteit van PRMTs voor hun substraten. De belangrijkste componenten voor het succes van deze test zijn: 1 Expressie van PRMTs in zoogdiercellen 2 Activiteit gezuiverd PRMTs, 3 Expressie en zuivering van substraat en 4 volledige western overdracht van de eiwitten aan het nitrocellulose membraan.
<p class="j…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door een Merit Award van het Amerikaanse Department of Veterans Affairs, en een NIH verlenen R01CA138528 naar RW.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
References
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).
- Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions. Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).
- Bedford, M. T. Arginine methylation at a glance. J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).
- Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Mol Cell. 33, 1-13 (2009).
- Bikkavilli, R. K., et al. Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate. Scientific reports. 2, 805 (2012).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA. J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2. J Cell Sci. , (2012).
- Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. Biochemical analysis of arginine methylation in transcription. Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).
- Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. Techniques in protein methylation. Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).
- Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. Methods applied to the study of protein arginine methylation. Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).
- Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues. J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).
