Summary

Haut différenciation de l'efficacité de pluripotentes humaines des cellules souches à des cardiomyocytes et caractérisation par cytométrie en flux

Published: September 23, 2014
doi:

Summary

L'article décrit la méthodologie détaillée pour différencier efficacement les cellules souches pluripotentes humaines dans les cardiomyocytes en modulant de manière sélective la voie Wnt, suivie d'une analyse par cytométrie en flux des marqueurs de référence pour évaluer l'homogénéité et l'identité de la population.

Abstract

Il ya un besoin urgent de développer des approches pour réparer le cœur endommagé, la découverte de nouveaux médicaments thérapeutiques qui n'ont pas d'effets toxiques sur le cœur, et l'amélioration des stratégies de modéliser avec précision les maladies cardiaques. Le potentiel de l'exploitation induite par les cellules souches pluripotentes (hiPSC) la technologie de l'humain pour générer muscle cardiaque "dans un plat" pour ces applications continue de susciter un grand enthousiasme. Au cours des dernières années, la capacité de générer efficacement des cellules cardiomyogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) s'est grandement améliorée, nous offrant de nouvelles possibilités pour modéliser un stade très précoce du développement cardiaque humaine pas accessibles autrement. Contrairement à de nombreux procédés antérieurs, le protocole de différenciation des cardiomyocytes décrit ici ne nécessite pas l'agrégation cellulaire ou l'addition d'activine A ou BMP4 et génère robuste des cultures de cellules qui sont hautement positives pour la troponine I cardiaque et T (TNNI3, TNNT2), iroquois- protéine à homéodomaine de classeIRX-4 (Irx4), la myosine réglementaire chaîne légère 2, isoforme ventriculaire / du muscle cardiaque (MLC2v) et la myosine réglementaire chaîne légère 2, isoforme auriculaire (MLC2a) par jour 10 dans l'ensemble cellule souches embryonnaires humaines (CSEh) et les lignes hiPSC testé pour jour. Les cellules peuvent être passées et entretenus pendant plus de 90 jours de culture. La stratégie est techniquement simple à mettre en oeuvre et économique. Caractérisation des cardiomyocytes dérivés de cellules pluripotentes comprennent souvent l'analyse de marqueurs de référence, à la fois au niveau de l'ARNm et des protéines. Pour l'analyse des protéines, la cytométrie de flux est un puissant outil d'analyse pour l'évaluation de la qualité des cellules en culture et la détermination de la sous-population homogène. Cependant, la variation technique dans la préparation de l'échantillon peut affecter considérablement la qualité de cytométrie de flux de données. Ainsi, la standardisation des protocoles de coloration devrait faciliter les comparaisons entre les différentes stratégies de différenciation. En conséquence, optimisé protocoles de coloration pour l'analyse de Irx4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, et TNNT2 par cytométrie de flux sont décrits.

Introduction

La génération de cardiomyocytes de hPSCs, y compris les CSEh et hiPSC, peut fonctionner comme un modèle in vitro de processus de développement cardiaques humaines très tôt, donnant un aperçu des étapes pas autrement accessibles pour des études mécanistiques. Ce système de modèle offre des opportunités uniques pour étudier les mécanismes moléculaires qui contrôlent l'engagement de la lignée cardiaque et la spécification du destin cellulaire. Au cours des dernières années, la capacité à générer de manière efficace à partir de cellules cardiomyogéniques hPSCs a grandement amélioré 1-15. Cependant, parmi les protocoles il existe une variation de la ligne de cellule par rapport à l'efficacité dans la production de cellules et cardiomyogéniques synchronisation à laquelle les cellules expriment des marqueurs spécifiques de la chambre (par exemple, le ventricule et oreillettes). Idéalement, pour des applications futures de ce système modèle, les populations plus homogènes de cellules fonctionnellement définies sont souhaitées. Contrairement aux procédés précédents, le protocole de différenciation des cardiomyocytes décrit ici ne nécessite pas CEagrégation ll ou l'ajout d'activine A ou protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4) et robuste génère cultures très positif pour TNNI3, TNNT2, Irx4, MLC2v, et MLC2a par jour 10 cellules dans toutes les lignées de CSEh et hiPSC testés à ce jour. La stratégie est techniquement simple à mettre en œuvre, en particulier par rapport à des cultures tridimensionnelles, la culture de masse, ou des stratégies fondées corps embryoïdes 4-9, et a récemment été définie dans une étude qui décrit une petite molécule à une toxicité sélective pour hPSCs (Boheler et al. ) 65. Caractéristiques de ce protocole comprennent la différenciation des hPSCs en culture monocouche à l'aide d'une seule couche d'une matrice qualifié CSEh (Matrigel), milieux entièrement définis à l'aide de petites molécules pour moduler la signalisation Wnt (semblable, mais distinct de 1,2,7,13), et flux optimisé cytométrie méthodes de coloration pour l'évaluation de l'efficacité de la différenciation et de l'identité de la cellule. En résumé, les avantages de ce protocole par rapport aux rapports précédents comprennent son coût effectivEness, reproductibilité, et sa grande efficacité pour générer des cardiomyocytes entre plusieurs lignes HPSC, y compris les lignées de CSEh et hiPSC.

La cytométrie en flux est un outil d'analyse puissant pour évaluer la qualité des cellules en culture et la détermination de la sous-population homogénéité, et avec un design expérimental approprié, peut fournir des mesures quantitatives. Comme pour toutes les stratégies à base d'anticorps, l'interprétation exacte des résultats expérimentaux nécessite que les éléments de la conception de l'essai, y compris la concentration d'anticorps et de la fixation des conditions de perméabilisation (lorsque ciblant des antigènes intracellulaires) sont soigneusement testés pour chaque anticorps comme des conditions sous-optimales affectent de manière significative l'efficacité de l'anticorps la liaison, et par conséquent, l'interprétation des résultats. Il est important, si la quantification est nécessaire, les anticorps monoclonaux sont indispensables, comme les anticorps polyclonaux peuvent reconnaître des epitopes multiples et sont sujettes à des variations de lot à lot. Actuellement, une variété d'anticorps (polyclonal protocoles et monoclonaux) et de coloration ont été décrits pour l'évaluation de la différenciation in vitro, ce qui rend difficile la comparaison de l'efficacité des protocoles cardiomyogenesis parmi 1,2,9,11. Pour cette raison, les anticorps monoclonaux sont utilisés lorsqu'ils sont disponibles pour toutes les analyses de cytométrie en flux. À l'avenir, il est prévu que la normalisation de ces protocoles de coloration, en particulier en ce qui concerne la quantification, devrait permettre une meilleure comparaison entre les stratégies de différenciation.

Le choix des marqueurs et leurs anticorps correspondants, utilisé pour évaluer la pureté de in vitro cardiomyogenèse varie selon les rapports. TNNT2 a été considéré comme un indicateur de cellules engagées au sort cardiomyogénique et est couramment utilisée pour évaluer l'efficacité des protocoles de différenciation cardiaques. Cependant, TNNT2 est également exprimée dans le muscle squelettique au cours de poussin et le développement du jeune rat 16,17 et il est présent dans le muscle lisse humain 18 </sup>. Ainsi, TNNT2 n'est pas nécessairement un marqueur spécifique de cardiomyogenesis humain in vitro. MLC2v et MLC2a sont couramment utilisés comme marqueurs de la ventriculaires et auriculaires sous-types, respectivement. Cependant, les défis de s'appuyer sur MLC2v et MLC2a pour déterminer le sous-type cardiomyocytes dans le contexte de la différenciation in vitro proviennent du fait que ces produits de gènes peuvent pas se limiter à une chambre spécifique au cours du développement cardiaque, du tube de cœur par adulte. Dans la boucle rongeur coeur, MLC2a ARNm est prédominante dans la / zone des voies d'entrée de l'oreillette et MLC2v ARNm est prédominante dans les régions du tractus ventriculaire / évacuation. Au coeur en boucle, la co-expression de MLC2a et MLC2v ARNm sont observés dans le tractus d'entrée, canal atrio-ventriculaire, et la voie d'éjection 19,20. En trois jours après la naissance, MLC2v ARNm est limitée au ventricule et de 10 jours après la naissance, MLC2a est limité aux oreillettes du coeur de rat nouveau-né 19. Par conséquent, l'interprétationde données concernant l'efficacité cardiomyogenèse et l'identité de sous-type ne doivent pas seulement tenir compte de la présence et la quantité de niveaux de marqueurs de référence, mais doivent tenir compte du stade de développement (s) à laquelle les points dans le temps de la différenciation qui sont analysés correspondent. Cela est particulièrement important étant donné que la phase de maturation des cellules cardiomyogéniques générées par la différenciation in vitro de hPSCs ressemble le plus à ceux du développement embryonnaire / 21-25. Ainsi, en s'appuyant sur l'expression spatiale d'un marqueur au cœur postnatale peut ne pas être approprié pour l'évaluation des cellules HPSC dérivés, au moins dans certains cas.

Dans un effort pour faciliter l'élaboration de critères plus spécifiques pour définir l'identité des cardiomyocytes in vitro, TNNI3 est considérée comme un marqueur utile pour évaluer cardiomyogenèse in vitro comme il est limité au muscle cardiaque tout au long de l'embryogenèse chez les poussins et le poisson zèbre 15,20et est absent dans le muscle squelettique foetal humain 26. Alors que TNNI1 est présent dans le cœur du fœtus humain, TNNI3 est la seule isoforme TNNI présente dans le cœur adulte normal 27,28. En ce qui concerne l'identité du sous-type cardiomyocytes, Irx4 29-31 est un marqueur informatif des cellules avec un sort ventriculaire. Au niveau de la protéine, Irx4 a récemment été montré être limitée au ventricule du tube cardiaque linéaire à travers les étapes néonatale chez la souris 32. En conséquence, les protocoles de coloration optimisés pour l'analyse de TNNI3 Irx4 et par cytométrie de flux sont décrits. À notre connaissance, ceci est la première description d'une méthode efficace pour la coloration et l'analyse des niveaux de Irx4 dans les cardiomyocytes humains à base d'anticorps par cytométrie de flux.

Protocol

1 Solution et préparation des médias CSEh Matrice qualifié revêtement Stock Solution Lentement dégeler CSEh matrice qualifié (5 ml) sur la glace à 4 ° C pendant la nuit. Distribuer aliquotes dans des tubes à centrifuger pré-réfrigérés, 1,5 ml stérile et stocker immédiatement à -20 ° C. REMARQUE: Le volume de l'aliquote varie en fonction de beaucoup et se situe typiquement 270-350 pi. Le fabricant fournit des détails concernant le volume de la portion aliquote nécessaire …

Representative Results

Au jour 0, les cellules sont confluentes à 100% avec la morphologie compacte et les débris de cellules minimal. Le jour 2.1, il est courant d'observer la mort cellulaire significative (40-50%), mais les cellules attachées conservera morphologie compacte (figure 1A). Pendant ce temps, les médias est orange et trouble. Médias rose indique la mort cellulaire excessive, et dans ce cas, confirmer au bleu trypan et cesser si la mort de la cellule dépasse 70%. Les cellules seront guéris pendant les …

Discussion

Critique pour la réussite du protocole de différenciation est l'utilisation de cultures de haute qualité de hPSCs qui ont été soumises à un passage à niveau de la cellule unique pendant au moins cinq passages avant le début de la différenciation. Différenciation efficacités similaires sont fréquemment observés chez les diverses lignes HPSC si elles sont confluentes à 100% au début de la différenciation indépendante de la lignée cellulaire. Efficacité sous-optimale est observée si la confluence de…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par le NIH 4R00HL094708-03, MCW Affaires de recherche Nouveau Comité Faculty Award, et la fondation Kern (fonds de démarrage) au Medical College of Wisconsin (RLG); Conseil des subventions de recherche de base-Thème Hong Kong programme de recherche et T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, et AHA Créé bourse de chercheur (JCW); AHA postdoctorale 12POST12050254 (PTB). Nous remercions l'espoir Campbell à la cytométrie en flux de base de l'Institut de recherche de sang de Wisconsin pour l'aide à la collecte de données et un examen attentif du manuscrit.

Materials

Name of Reagent / Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow cytometry reagents
Phosphate buffered saline (10X) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 for preparation of cells for flow cytometry
5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 for preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6 well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 mL syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding  Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding  Corning 431097 For filter sterilization of bulk media 
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960

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Citer Cet Article
Bhattacharya, S., Burridge, P. W., Kropp, E. M., Chuppa, S. L., Kwok, W., Wu, J. C., Boheler, K. R., Gundry, R. L. High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010, doi:10.3791/52010 (2014).

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