Имплантация фибрина гель на Мышь легких для изучения легких специфическую ангиогенеза

Summary

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

Abstract

Последние значительные успехи в технике исследования стволовых клеток и биоинженерных сделали большой шаг вперед в использовании биоматериалов для регенерации и устранения повреждений в простых тканей в ортопедических и пародонта полей. Однако попытки восстановить структуры и функции более сложных трехмерных (3D) органов, таких как легкие были не очень успешными, потому что биологические процессы регенерации органов не были хорошо изучены. Становится ясно, что ангиогенез, образование новых кровеносных сосудов, играет ключевую роль в регенерации органов. Вновь образованные vasculatures не только доставляют кислород, питательные вещества и различные компоненты клеток, которые необходимы для регенерации органов, но также обеспечивают инструктивные сигналы регенерирующей местных тканей. Поэтому, чтобы успешно восстановить легкие у взрослого, необходимо повторять легких конкретных микросреды, в котором ангиогенез дисков регенерацию местных тканей легких. Хотя соnventional в естественных условиях ангиогенеза анализы, такие как подкожной имплантации внеклеточного матрикса (ЕСМ), обогащенный гидрогели (например, фибрин или коллагеновые гели или Matrigel – ECM смеси белков, выделяемый Engelbreth-Холм-рой мыши клеток саркомы), широко используемой для изучения Общие механизмы ангиогенеза, легких конкретных ангиогенез не были хорошо охарактеризованы, потому что методы ортотопической имплантации биоматериалов в легких не установлены. Цель этого протокола является внедрение уникальный метод имплантации фибрина гель на поверхности легких живой взрослой мыши, что позволяет для успешного рекапитуляции хозяина легких, полученных ангиогенеза внутри геля. Такой подход позволяет исследователям изучить механизмы, посредством которых легких конкретных микросреда контролирует ангиогенез и альвеолярной регенерации в нормальных, так и патологических состояний. Так, имплантированных биоматериалов выпуска и обеспечивать физических и химических сигналов в соседней лUNG ткани, имплантация этих биоматериалов на больного легкого может потенциально нормализовать соседние больные ткани, что позволяет исследователям разработать новые терапевтические подходы для различных видов заболеваний легких.

Introduction

Общая цель этого протокола является введение метод имплантации фибрина гель на поверхности легких у взрослых мышей, что позволяет исследователям характеризовать молекулярные механизмы легких сосудистой и альвеолярной развития, а также возможность использовать эти знания для того, чтобы развивать биомиметических материалов, способных из обобщал физиологической сосудистой легких и альвеол образование для лечения различных заболеваний легких.

Более 35 миллионов американцев страдают от хронических заболеваний легких, включая хроническое обструктивное заболевание легких и фиброз легких. Эти пациенты имеют долгосрочные хронические респираторные симптомы, такие как затрудненное дыхание, стеснение в груди, нытье кашель и усталость, которые существенно снижают их повседневную жизнь ^1-3. Несмотря на большое количество усилий, чтобы разработать эффективные методы лечения этих заболеваний легких, в настоящее время нет никакого лечения; Поэтому, качество жизни этих больных бедных и экономической и человеческие затраты приветGH ^4-7. В настоящее время трансплантация легких является единственным способом спасти пациентов с терминальной стадией хронических заболеваний легких. Тем не менее, из-за нехватки трансплантатов доноров, высокая стоимость, серьезные осложнения, и низкая выживаемость ^8-11, трансплантация не оптимальный подход. Последние быстрый прогресс в инженерии тканей позволил ученым биоинженер имплантируемый легких путем заселения decellularized всего легкого с различными типами клеток-предшественников или индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток ^12,13. Тем не менее, эти легкие биоинженерии функциональным в животных-хозяев только в течение нескольких часов после имплантации ^12,14,15. Использование биоматериалов для регенерации сложные структуры и функции легких также было довольно неудачным. Это может быть потому, что ключевые биологические процессы, которые управляют взрослых регенерации легких не были хорошо изучены. В легких, формирование сосудистой системы является одним из самых ранних и самых важных событий Дуриразвитие нг и регенерация ^16-21. Вновь созданная vasculatures в легких не только доставляют кислород, питательные вещества и различные клеточные компоненты, необходимые для формирования органов, но и представляют собой поучительные регуляторные сигналы для окружающих клеток ^22-25. Таким образом, ангиогенез играет ключевую роль в регенеративной alveolarization у взрослых легкие ^24,26,27. Кроме того, дерегулирование ангиогенез способствует хронических заболеваний легких, таких как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) ^28, бронхолегочной дисплазии (БЛД) ^21-23 и фиброз легких ^29. Таким образом, для разработки более эффективных стратегий для инженерных легкие или лечения хронических заболеваний легких, необходимо понять основные механизмы легких конкретных ангиогенеза.

Каждый орган отображает уникальные механические и химические свойства, которые могут отличаться от физиологических и патологических условиях ^30-33. Это органо-специфическое microenvironменты регулируют эндотелиальные поведения клеток и организовать формирование сосудистой сети в органе-специфическим образом ^24,34-36. Таким образом, для разработки более эффективных стратегий для регенерации легких, механизм, лежащий в основе легких конкретных ангиогенез нужно понимать. В то время как обычные в естественных условиях ангиогенеза анализы, такие как подкожной гидрогеля имплантации широко используются для ангиогенеза исследований ^37-39, эти методы не воспроизводят специфические для органа ангиогенез. В последнее время, новый способ имплантировать Матригель в упругом плесени на легкого мыши был разработан и было показано, успешно набирать кровеносные сосуды и легкие эпителиальные клетки в гелях ^22. Этот уникальный подход позволит исследователям изучить механизм легких конкретных ангиогенеза, а также взаимодействия между кровеносными сосудами и не-сосудистых клеток легких в физиологических и патологических условиях. С 1) Matrigel не подходит для клинического применения; 2) еLastic Используемая форма для отливки гель может повлиять на взаимодействие между гидрогелей и хозяин легочной ткани и 3) упругой плесень на легких потенциально приводит к нарушению функции легких и боли при дыхании, как более клинически значимого подхода, 3D матрица фибрина, содержащий ангиогенные факторы (сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) / основной фактор роста фибробластов (bFGF)) был имплантирован на легких мыши без заливки в пресс-форму упругого и успешно воспроизводятся хоста легких, полученных ангиогенез. Фибрина гель, полимерные волокна, полученные из расщепленного тромбином фибриногена, как известно, ловушки различные ангиогенных факторов, таких как bFGF и VEGF, чтобы ускорить ангиогенеза в естественных условиях ^40,41. Из-за своей восстановительной способности и биоразлагаемого характера ^42, фибрина гель широко используется в области тканевой инженерии.

Эта статья представляет собой новый и уникальный подход к имплантации фибрина гель на поверхности легких живого ADULт мыши и демонстрирует, что хозяин легких, полученных ангиогенез воспроизводятся внутри гелей в естественных условиях. Это метод, который позволяет исследователям изучать легких конкретных ангиогенез, вероятно, приведет к разработке новых терапевтических подходов для различных видов заболеваний легких и значительно продвинет вперед усилия, чтобы успешно восстанавливают взрослых легкое.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: в естественных условиях исследование на животных было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Протокол был рассмотрен и одобрен уходу и ис…

Representative Results

Чтобы исследовать, будет ли хост воспроизводятся легких, полученных сосудистой образование внутри биоматериалов имплантированных на легких, фибрина гели с добавлением основного ангиогенных факторов VEGF и bFGF (0, 10 и 100 нг / мл каждого) были имплантированы на поверхности живых легких мыше?…

Discussion

Эта статья вводит новый способ имплантировать биоматериалов на поверхности легких жизни взрослой мыши. С помощью этой системы, принимающей легких, полученных ангиогенез успешно воспроизводятся внутри материала. Эта система позволяет исследователи, чтобы исследовать перекрестные по…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fibrinogen from human placenta	Sigma	F4883	For fabrication of fibrin gel
Thrombin from bovine plasma	Sigma	T9549	For fabrication of fibrin gel
Recombinant mouse VEGF 164	R&D	493-MV	For supplementation to fibrin gel
Recombinant mouse bFGF	R&D	3139-FB	For supplementation to fibrin gel
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific INC	RIS 100	For intubation
Fiber-Optic Light Source	Fisher Scientific	12-565-35	For intubation
20G Elastic catheter	B.Braun	4251652-02	For intubation
MiniVent Ventilator	Harvard Apparatus	CGS-8009	For ventilation
Stemi DV4 Steromicroscope	Fisher Scientific	12-070-515	For surgey
Absobable suture	Ethicon	PDP304	Surgical suture
Antibody against CD31	BD Biosciences	553370	Immunohistochemistry
Antibody against AQP5	Abcam	AB78486	Immunohistochemistry
Antibody against SP-B	Millipore	AB40876	Immunohistochemistry