Implantation af fibringel om Mouse Lung til Uddannelse Lunge-specifik Angiogenesis

Summary

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

Abstract

Nylige betydelige fremskridt i stamcelleforskning og naturnær teknikker har gjort store fremskridt i at udnytte biomaterialer til at regenerere og reparere skader i simple væv i ortopædiske og parodontale felter. Men forsøg på at regenerere de strukturer og funktioner af mere komplekse tredimensionale (3D) organer såsom lunger ikke har været meget vellykket, fordi de biologiske processer organregenerering ikke er blevet godt undersøgt. Det bliver tydeligt, at angiogenese, dannelsen af ​​nye blodkar, spiller en central rolle i orgel regenerering. Nydannede vaskulaturerne ikke kun levere ilt, næringsstoffer og forskellige cellekomponenter, der er nødvendige for organregenerering men også give instruktive signaler til regenererende lokale væv. Derfor, for at succesfuldt regenerere lungerne i en voksen, er det nødvendigt at rekapitulere lunge-specifikke mikromiljøer, hvor angiogenese drev regenerering af lokale lungevæv. Selvom conventional in vivo angiogenese assays, såsom subkutan implantation af ekstracellulær matrix (ECM) -rige hydrogeler (fx fibrin eller kollagengeler eller Matrigel – ECM proteinblandingen udskilles af Engelbreth-Holm-Swarm muse sarcomaceller) er udstrakt anvendt til at undersøge generelle mekanismer angiogenese, lunge-specifikke angiogenese er ikke blevet godt karakteriseret fordi fremgangsmåder til orthotopisk implantation af biomaterialer i lungen ikke er blevet godt etableret. Målet med denne protokol er at indføre en unik metode til at implantere fibringel på lungeoverfladen af ​​levende voksne mus, der giver mulighed for en vellykket sammenfatning af host lunge-afledte angiogenese inde i gelen. Denne tilgang gør det muligt for forskerne at undersøge de mekanismer, som lunge-specifikke mikromiljø styrer angiogenese og alveolær regenerering i både normale og patologiske tilstande. Da implanterede biomaterialer frigivelse og leverer fysiske og kemiske signaler til tilstødende lUng væv, kan implantation af disse biomaterialer på syge lunge potentielt normalisere de tilstødende syge væv, der gør det muligt for forskerne at udvikle nye behandlingsformer til forskellige typer af lungesygdomme.

Introduction

Det overordnede mål med denne protokol er at indføre en metode til at implantere fibringel på lungeoverfladen af ​​voksne mus, som gør det muligt for forskerne at karakterisere de molekylære mekanismer i lunge vaskulær og alveolær udvikling, og til at udnytte denne viden til at udvikle biomimetiske materialer stand af opridset fysiologisk lunge vaskulære og alveolære formation til behandling af forskellige lungesygdomme.

Mere end 35 millioner amerikanere lider af kroniske lungesygdomme, herunder kronisk obstruktiv lungesygdom og lungefibrose. Disse patienter har langvarige kroniske luftvejssymptomer som åndenød, trykken for brystet, nagende hoste og træthed, som indskrænker deres hverdag ^1-3. På trods af en stor mængde indsats for at udvikle effektive behandlinger for disse lungesygdomme, i øjeblikket er der ingen kur; Derfor livskvaliteten for disse patienter er fattige og økonomisk og menneskelige omkostninger er high ^4-7. I øjeblikket lungetransplantation er den eneste måde at redde patienter med terminal fase kronisk lungesygdomme. Men på grund af manglen på transplanterede donorer, høje omkostninger, alvorlige komplikationer, og lav overlevelsesrate ^8-11, transplantation er ikke en optimal tilgang. Seneste hurtige fremskridt i væv teknikker har gjort det muligt for forskerne at bioengineer implanterbar lunge ved genbefolkning decellulariserede hele lunge med forskellige typer af stamceller eller inducerede pluripotente stamceller (IPS) celler ^12,13. Men disse gensplejsede lunger er funktionelle i værtsdyr kun i flere timer efter implantation ^12,14,15. Udnytte biomaterialer til at regenerere de komplekse strukturer og funktioner lunger har også været temmelig mislykket. Det kan være fordi vigtige biologiske processer, der styrer voksen lunge regenerering ikke er blevet godt undersøgt. I lungen, dannelse af det vaskulære system er en af ​​de tidligste og mest vigtige begivenheder During udvikling og regeneration ^16-21. Nydannede vaskulaturerne i lungerne ikke blot levere ilt, næringsstoffer og forskellige celle komponenter, der kræves for dannelse orgel, men også give lærerige regulatoriske signaler til omkringliggende celler ^22-25. Således angiogenese spiller centrale roller i regenerativ alveolarization hos voksne lunger ^24,26,27. Desuden dereguleret angiogenese bidrager til kroniske lungesygdomme, såsom kronisk obstruktiv lungesygdom (COPD) ^28, bronkopulmonal dysplasi (BPD) ^21-23, og lungefibrose ^29. Således at udvikle mere effektive strategier for Engineering lunger eller behandling af kroniske lungesygdomme, er det nødvendigt at forstå de grundlæggende mekanismer i lunge-specifikke angiogenese.

Hvert organ viser unikke mekaniske og kemiske egenskaber, som kan være forskellige mellem fysiologiske og patologiske tilstande ^30-33. Disse organ-specifikke microenvironmenter regulere endotelcellespecifikke adfærd og orkestrere vaskulær netværksdannelse i et organ-specifik måde ^24,34-36. Således at udvikle mere effektive strategier for lunge regenerering mekanismen bag lunge-specifik angiogenese skal forstås. Mens konventionelle in vivo angiogenese assays, såsom subkutan hydrogel implantation er blevet anvendt i udstrakt grad til angiogenese forskning ^37-39, behøver disse metoder ikke rekapitulere organspecifik angiogenese. For nylig er en hidtil ukendt fremgangsmåde til at implantere Matrigel i en elastisk mug på muselunge blevet udviklet og vist held blodkar og lungeepitelceller i gelerne ^22. Denne unikke fremgangsmåde vil gøre det muligt for forskerne at undersøge mekanismen for lunge-specifikke angiogenese samt interaktioner mellem blodkar og ikke-vaskulære lungeceller i fysiologiske og patologiske tilstande. Siden 1.) Matrigel er ikke egnet til klinisk anvendelse; 2) eLastic Støbeform til gelen kan påvirke samspillet mellem hydrogeler og vært lungevæv og 3) den elastiske mug på lungen potentielt forårsager forringelse af lungefunktionen og smerter under respiration, som en mere klinisk relevant tilgang, en 3D fibrin matrix indeholdende angiogene faktorer (vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) / basisk fibroblast vækstfaktor (bFGF)) er blevet implanteret på muselunge uden støbning i den elastiske form, og har med succes gentaget vært lunge-afledt angiogenese. Fibrin gel, polymer fibriller genereret fra trombinspaltede fibrinogen, er kendt for at fælde en række angiogene faktorer, såsom bFGF og VEGF at fremskynde angiogenese in vivo ^40,41. På grund af sin regenerative evne og bionedbrydelige karakter ^42, fibringel udbredt inden for tissue engineering.

Denne artikel introducerer en ny og unik tilgang til implantere fibringel på lungeoverfladen af ​​levende Adult mus og viser, at host lunge-afledt angiogenese sammenfattet inde i geler in vivo. Denne metode, som gør det muligt for forskerne at studere lunge-specifikke angiogenese, sandsynligvis vil føre til udvikling af nye behandlingsformer til forskellige typer af lungesygdomme og væsentligt videre bestræbelser på at succes regenerere voksen lunge.

Protocol

BEMÆRK: in vivo dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr i National Institutes of Health. Protokollen blev revideret og godkendt af Animal Care og brug Udvalg Boston Børnehospital (Protokol Numbers: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Alle lægemidler, der anvendes i denne protokol er farmaceutisk kvalitet og disse lægemidler fremstilles under sterile forhold. 1. fibringel Fremstilling Forbered fi…

Representative Results

For at undersøge om host lunge-afledte vaskulær dannelse rekapituleres inde i biomaterialer implanteret på lungen, fibringeler suppleret med større angiogene faktorer VEGF og bFGF (0, 10 og 100 ng / ml hver) blev implanteret på overfladen af ​​levende mus lungerne rapporteret ved brug Matrigel 22. Fibringeler 47, der indeholder disse angiogene vækstfaktorer blev fremstillet som vist i figur 1a. Efter torakotomi blev et lille område af den venstre lunge med skrabet overfl…

Discussion

Denne artikel introducerer en ny metode til at implantere biomaterialer på lungeoverfladen af ​​levende voksne mus. Med dette system er vært lunge-afledt angiogenese held gentaget inde i materialet. Dette system gør det muligt for forskere at undersøge krydstale mellem endotelceller andre celler (f.eks epitelceller, mesenkymale celler, immunceller) og forskellige ECM komponenter, der er nødvendige for lokal angiogenese ^50-53 og alveolær regenerering ^24,54. Selvom konventionelle <…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fibrinogen from human placenta	Sigma	F4883	For fabrication of fibrin gel
Thrombin from bovine plasma	Sigma	T9549	For fabrication of fibrin gel
Recombinant mouse VEGF 164	R&D	493-MV	For supplementation to fibrin gel
Recombinant mouse bFGF	R&D	3139-FB	For supplementation to fibrin gel
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific INC	RIS 100	For intubation
Fiber-Optic Light Source	Fisher Scientific	12-565-35	For intubation
20G Elastic catheter	B.Braun	4251652-02	For intubation
MiniVent Ventilator	Harvard Apparatus	CGS-8009	For ventilation
Stemi DV4 Steromicroscope	Fisher Scientific	12-070-515	For surgey
Absobable suture	Ethicon	PDP304	Surgical suture
Antibody against CD31	BD Biosciences	553370	Immunohistochemistry
Antibody against AQP5	Abcam	AB78486	Immunohistochemistry
Antibody against SP-B	Millipore	AB40876	Immunohistochemistry