Analysen af ​​neurovaskulære Remodeling i Entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer

Summary

En protokol til entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer, som gør det muligt at gengive mange aspekter af iskæmisk hjerneskade, er præsenteret. Ved at studere ændringer i neurovasculature udover ændringer i neuroner denne protokol er et alsidigt værktøj til at studere ændringer plast i nervevæv efter skade.

Abstract

Iskæmisk hjerneskade er blandt de mest almindelige og ødelæggende betingelser, som forringer korrekt hjernens funktion og ofte fører til vedvarende funktionelle mangler i de berørte patienter. Trods intensiv forskning, er der stadig ingen effektiv behandling til rådighed, der reducerer neuronal skade og beskytter neuroner i iskæmiske områder fra forsinket sekundær død. Forskning på dette område involverer typisk brugen af ​​kunstfærdige og problematiske dyremodeller. Entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer udfordret med ilt og glukose afsavn (OGD) er etableret in vitro modeller, der efterligner cerebral iskæmi. Det hidtil ukendte aspekt ved denne undersøgelse er, at ændringer i hjernens blodkar undersøgt i tillæg til neuronale ændringer og omsætning af både neuronale rum og det vaskulære rum kan sammenlignes og korreleret. De metoder, der præsenteres i denne protokol væsentligt udvide de potentielle anvendelser af ellerganotypic skive kultur tilgang. Induktionen af ​​OGD eller hypoksi alene kan anvendes ved forholdsvis simple midler i organotypiske skive kulturer og fører til en pålidelig og reproducerbar skader i nervevæv. Dette er i skarp kontrast til de komplicerede og problematiske dyreforsøg inducerer slagtilfælde og iskæmi in vivo. Ved at udvide analysen til også at omfatte undersøgelse af reaktionen af ​​karrene kunne give nye måder om, hvordan at bevare og genoprette hjernens funktioner. Den skive kultur strategi, der fremlægges her, kan udvikle sig til et attraktivt og vigtigt redskab for studiet af iskæmisk hjerneskade og kan være nyttig til at teste potentielle terapeutiske foranstaltninger med henblik på neuroprotektion.

Introduction

Det centrale nervesystem er særlig følsomt over for et tab eller reduktion af ilt og glukose levering fra karrene. Selv en forholdsvis kort afbrydelse af blodforsyning til hjernen kan inducere et permanent tab af funktion af de relevante områder i hjernen, der fører til de typiske slagtilfælde syndromer. Ud over den neuronale tab i de primære berørte områder, der typisk er yderligere forsinket neuronal tab gennem sekundær skade. Desværre indtil nu, ingen neurobeskyttende behandling til reduktion af sekundær neuronal død var tilgængelig ^1. Forskningsindsatsen for at studere de mekanismer for sekundær skade stole på brugen af dyremodeller for cerebral iskæmi som mellem-cerebral arterieokklusion og forskellige trombotiske okklusion teknikker (for en nylig se ^2). Parallelt hermed på grund af begrænsninger og etiske betænkeligheder ved brug af dyremodeller, organotypisk skive kultur af flere forskellige CNS væv også have været brugt som tillader study af neuronale reaktioner på forskellige typer af skader ^3-5.

For at studere den neuronale reaktion under betingelser, der efterligner iskæmisk hjerneskade, har modelsystemet af ilt glucosemangel (OGD) blevet udviklet. I denne model er skivekulturer midlertidigt udsat for et medium, der mangler glukose og er blevet ækvilibreret med nitrogengas i fravær af oxygen. Med en sådan behandling, er det muligt at inducere neuronal skade og tab, som er temmelig svarer til den observeret efter iskæmisk skade in vivo ^{6, 7.} I hippocampus sådan behandling inducerer neurontab specifikt i CA1, men ikke i CA3-området eller gyrus dentatus i hippocampus. I modsætning hertil, undersøgelse af vaskulære reaktioner i skivekulturer hidtil ikke blevet bredt iværksat. En oplagt årsag er den manglende cirkulation og blodkar perfusion i skive kultur modellen. Men vi har tidligere vist, at det er muligt at opretholde bLood fartøjer i CNS skivekulturer i flere dage ^{8, 9.}

Det overordnede mål med denne metode er at ikke blot overvåge skæbnen af ​​neuroner efter OGD men udvide undersøgelsen til skæbne og ombygning af karrene, som er en vigtig del af den skade respons. Indtil nu sådanne undersøgelser har krævet brugen af dyreforsøg (De Jong et al, 1999;. Cavaglia m.fl., 2001.). I protokollen fremlagt her, vil vi beskrive, hvordan sådanne undersøgelser kan udføres i entorhino-hippocampus organotypiske skive kulturer udfordret, enten med hypoxi eller excitotoksiske læsioner efterfulgt af analyse af både neuronal overlevelse og blodkar reaktioner. Denne protokol er baseret på en tidligere offentliggjort undersøgelse om dette emne ¹⁰ og kan være nyttige for alle laboratorier interesseret i neurovaskulære interaktioner i centralnervesystemet.

Protocol

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers direktiv af 22. september 2010 (2010/63 / EU) og blev revideret og godkendt af de schweiziske myndigheder. 1. Opsætning Organotypiske Entorhino-hippocampus skivekulturer Forbered entorhino-hippocampus organotypiske skive kulturer (EHOSCs) fra postnatal dag 4 (P4) museunger ved hjælp af den statiske inkubation metode 4,11. Her, brug C57BL6 og CB6F1 mus. Tage cirka 30 minutter pr mus …

Representative Results

Ilt glucosemangel og hypoxi fremkalde neuronal død og reduktion blodkar specifikt i hippocampus CA1 regionen. OGD eller oxygen-berøvelse alene i 15 min inducerede en stærk induktion af celledød, som ses ved propidiumiodidfarvning specifikt i CA1-området i hippocampus (figur 3), som svarer som tidligere beskrevet 7. Med markører at visualisere netværk af blodkar, blev det konstateret, at blodkar tæthed og organisation at være lig kontrollen efter OGD udfordring i de fl…

Discussion

Med de metoder, der præsenteres her, hippocampus organotypiske skive kulturer anvendes som et alsidigt værktøj til at studere ændringer plast i nervevæv efter skade. Mens organotypiske skive kulturer er blevet anvendt i fortiden for at studere neuronale reaktioner efter iskæmi ^{6, 7,} nyt aspekt af den samtidige undersøgelse af vaskulære ændringer forbedrer de potentielle anvendelser af denne metode. Induktionen af ​​OGD eller hypoksi alene kan anvendes ved forholdsvis simple midler i organotypiske…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Minimum Essential Medium MEM	Gibco	11012-044
Glutamax	Gibco	35050-061	stabilized form of L-glutamine
Millicell cell culture inserts	Millipore	PICM03050
Basal medium Eagle	Gibco	41010-026
Horse serum	Gibco	26050-088
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
B27 supplement	Gibco	17504-044
Anaerobic strips	Sigma-Aldrich	59886
Propidium iodide solution	Sigma-Aldrich	P4864
AMPA	R&D systems	0169-10
CNQX	R&D systems	0190/10
TTX	R&D systems	1078/1
polyclonal anti-laminin	Sigma-Aldrich	L9393
anti-MAP2	Abcam	ab11267
Alexa anti mouse 350	Molecular Probes	A11045
Alexa anti mouse 488	Molecular Probes	A11001
Alexa anti rabbit 350	Molecular Probes	A11046
Alexa anti rabbit 488	Molecular Probes	A11008
Statistics software	GraphPad Software	GraphPad Prism
McIlwain tissue chopper	Ted Pella	10180
Hypoxia chamber	Billups-Rothenberg	MIC-101