Анализ нейрососудистой ремоделирования в Entorhino-гиппокампа культуры Органотипической Slice
Summary
Протокол для entorhino-гиппокампа органотипической срез культуры, который позволяет воспроизводить многие аспекты ишемического повреждения головного мозга, представлен. Изучая изменения в neurovasculature в дополнение к изменениям в нейронах, этот протокол является универсальным инструментом для изучения пластиковые изменения в нервной ткани после травмы.
Abstract
Ишемического повреждения головного мозга является одним из наиболее распространенных и разрушительных условиях компрометирующих нормальной работы мозга и часто приводит к сохраняющиеся функциональные дефициты в пострадавших пациентов. Несмотря на интенсивные усилия научно-исследовательских, там до сих пор нет эффективной вариант лечения, что снижает повреждение нейронов и защищает нейроны в ишемических областях от отсроченного вторичного смерти. Исследования в этой области, как правило, включает в себя использование сложных и проблемных животных моделях. Entorhino-гиппокампа органотипической срез культуры оспаривались с кислородом и лишения глюкозы (OGD) устанавливаются в моделях пробирке, которые имитируют церебральной ишемии. Новым аспектом данного исследования является то, что изменения в кровеносных сосудов головного мозга изучаются в дополнение к нейронных изменений и реакции как нейронов отсека и сосудистой отсека можно сравнить и взаимосвязаны. Методы, представленные в данном протоколе существенно расширить возможности применения илиganotypic ломтик культура подход. Индукция OGD или только гипоксии может быть применено достаточно простыми средствами в органотипических срез культуры и приводит к надежным и воспроизводимым повреждения в нервной ткани. Это резко контрастирует с сложных и проблемных экспериментах на животных, вызывающих инсульт и ишемии в естественных условиях. Расширяя анализ включить изучение реакции сосудистой могут обеспечить новые способы, как сохранить и восстановить функции мозга. Подход ломтик культура представлена здесь может развиваться в привлекательный и важный инструмент для изучения ишемического повреждения головного мозга и могут быть полезны для тестирования потенциальных терапевтических мер, направленных на нейропротекции.
Introduction
Центральная нервная система особенно чувствительна к потере или снижению кислорода и питания глюкозы сосудистой. Даже довольно короткий перерыв кровоснабжения мозга может вызвать постоянную потерю функции соответствующих областях мозга, ведущих к типичных синдромов инсульта. В дополнение к гибели нейронов в первичных пораженные участки, что, как правило, является дополнительной задержкой гибель нейронов за счет вторичного повреждения. К сожалению, до сих пор ни нейропротекторное лечение для снижения среднего гибели нейронов был доступен 1. Научно-исследовательская для изучения механизмов вторичного повреждения полагаться на использование животных моделях церебральной ишемии как окклюзии средней мозговой артерии и различных тромботических методов окклюзии (для недавнем обзоре см 2). Параллельно, также вследствие ограничений и этических проблем с применением моделей животных, органотипической культуре Кусочек различных тканей ЦНС были использованы, что позволяет Stuду нейронных реакций на различного типа травм 3-5.
Для изучения нейронов реакцию в условиях, которые имитируют ишемического повреждения головного мозга, модель системы в виде лишения глюкозы кислорода (OGD) была разработана. В этой модели, срез культуры временно воздействию среды, который испытывает недостаток глюкозы и была уравновешена газообразным азотом при отсутствии кислорода. При таком лечении, можно вызвать повреждение нейронов и потерю который довольно похож на тот, наблюдаемого после ишемического повреждения в естественных 6, 7. В гиппокампе, такая обработка вызывает потерю нейронов в частности, в СА1, но не в CA3 площадь или зубчатая извилина гиппокампа. В отличие от этого, изучение сосудистых реакций в срез культуры до сих пор широко не проводилось. Очевидная причина является отсутствие циркуляции и кровеносных сосудов перфузии в модели ломтик культуры. Тем не менее, мы показали ранее, что можно поддерживать BLOOD сосуды в ЦНС срез культуры в течение нескольких дней 8, 9.
Общая цель этого метода является не только следить за судьбу нейронов после OGD но расширить исследование с судьбой и ремоделирования сосудистой которая является важной частью ответа травмы. До сих пор такие исследования не требует использования экспериментов на животных (Де Йонг и др., 1999; Cavaglia др, 2001.). В протокол, представленные здесь, мы будем подробно, как такие исследования можно сделать в entorhino-гиппокампа органотипических культур срез вызов либо с гипоксией или экзайтотоксическим поражений с последующим анализом обоих нервных реакций выживания и кровеносных сосудов. Этот протокол основан на ранее опубликованном исследовании на эту тему 10 и могут быть полезны для любой лаборатории, заинтересованного в сосудисто-нервных взаимодействий в ЦНС.
Protocol
Representative Results
Discussion
С методов, представленных здесь, гиппокампа органотипической культуры ломтик может быть использован в качестве универсального средства для изучения изменений в пластиковые нервной ткани после травмы. В то время как органотипической культуры ломтик были использованы в прошлом для из…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана в Базельском университете, факультет биомедицине и Швейцарского национального научного фонда (31003A_141007). Маркус Saxer оказала техническую поддержку.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
| Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa anti mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa anti rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa anti rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
References
- Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success. J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).
- Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia. Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).
- Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors. Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).
- Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase. C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).
- Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).
- Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier. J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).
- Camenzind, R. S., et al. Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier. Neurosciences. 170, 361-371 (2010).
- De Jong, G. I., et al. Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment. Neurosciences. 91, 203-210 (1999).
- Cavaglia, M., et al. Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia. Brain Res. 910, 81-93 (2001).
- Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
