Methoden voor-Cell bevestigd Capaciteitsmetingen in Muis bijnier Chromaffinecellen Cell

Summary

After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

Abstract

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.

Introduction

Synaptische transmissie gemedieerd door exocytose van neurotransmitter bevattende synaptische blaasjes en deze vesicles moeten lokale endocytische recycling in het zenuwuiteinde ondergaan neuronale communicatie op lange termijn. Gezien de essentiële rol van synaptische transmissie in de hersenen, het begrijpen van de moleculaire machinerie die vormt het synaptische vesikel cyclus is een essentiële basis op weg naar een beter begrip van de cellulaire communicatie als geheel. Onder cel modelsystemen, heeft de adrenale chromaffine cel aantal van de meest definitieve inzichten in de moleculaire machinerie onderliggende synaptische vesikel recycling. Exocytose, de laatste stap in neurotransmitter afgifte, is enorm bestudeerd en door gebruikmaking van de adrenale chromaffine cel ^1,2 onderzocht. In feite zijn de meeste van de moleculaire spelers die de vorming, targeting, docking, en fusie van secretoire korrels orkestreren geïdentificeerd als gevolg van toepassing van diverse technieken chromaffinecellen ^1. Bovendien, door de mogelijkheid om voor eenmalig vesicle resolutie van het eiwit machine betrokken exocytose, de chromaffine cel nog altijd een model op de vragen van de vesikel fusie ³ pakken.

Cel verbonden capaciteitsmetingen werden eerst gebruikt bij het ​​oplossen van enkele vesikel fusie gedurende exocytose ^3. Exocytosis vesicles van slechts ~ 60 nm in diameter is aangetoond worden gedetecteerd door celmembraan toegang metingen met de patch clamp techniek in de cel bijgevoegde configuratie ^4-7. Toegang wordt gedefinieerd als een maat voor hoe gemakkelijk een circuit of apparaat zal een stroom vloeien; is de inverse van impedantie. Aldus toelating metingen geven inzicht in de membraancapaciteit. Dit wordt bewerkstelligd door de opname van de vesiculaire membraan in de plasmamembraan; deze integratie blijkt dat er veranderingen in het oppervlakGebied ^8. Elke fusing blaasje zorgt voor een stapsgewijze verhoging van de membraan capaciteit ^9,10. Daarnaast biedt deze toegang meting geeft het membraan geleidbaarheid en het fusie porie geleiding tijdens een exocytotische event ^3. Omdat deze techniek een uniek instrument op het identificeren van enkel-blaasje kinetiek tijdens exocytose heeft verstrekt, heeft ons lab onlangs toegepast dit concept tot endocytose van enkele blaasjes ^11,12 detecteren.

Onze specifieke belang clathrine gemedieerde endocytose (CME), die is beschouwd als een fundamenteel housekeeping component in vele cellen ¹³ en als een belangrijke route voor synaptische blaasjes endocytose in neuronale terminals ^14,15. CME is bekend biologisch belangrijk te zijn, echter, zijn de kinetiek nog niet goed begrepen door technische beperkingen bij het toezicht enkelvoud endocytisch evenementen. Gezien de overeenkomsten in exocytische mechanismen tussen chromaffin cellen en neuronen ^1, is het plausible dat de kernsplijting mechanismen in chromaffinecellen waarschijnlijk kan gelden voor synaptische blaasjes endocytose in neuronen. De cel bijgevoegde capaciteitsmetingen zijn gebruikt volgen individuele endocytische gebeurtenissen en de splitsing kinetiek, die de meeste methoden niet kunnen opgelost analyseren. In onze cel bevestigd opnames wordt een sinus bij 20 kHz weergegeven over het houden van potentieel, en de output stroom wordt gescheiden in membraan geleiding in het ene kanaal en membraan capaciteit in het andere kanaal van een twee-fase lock-in versterker ^{16- 18.} Van de veranderingen in het membraan geleiding en capaciteit, kan men de kinetiek van de splitsing poriën, die waarschijnlijk overeenkomt met het buisvormige membraan hals dat de internaliserende blaasje verbinding met de plasmamembraan vóór vesikel pinch-off berekenen. Collectief, deze techniek geeft ons de gelegenheid om de regulerende mechanismen van blaasje kernsplijting onderzoeken tijdens CME.

Protocol

OPMERKING: De hele procedure werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health, zoals goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Illinois in Chicago. 1 Solutions en cultuur Media Voorbereidingen Houd alle oplossingen bij -20 ° C gedurende maximaal zes maanden. Houd het kweekmedium bij 4 ° C gedurende maximaal 3 maanden. Bereiding van 100 ml van de cultuur media door het mengen van 1 ml van pen-stre…

Representative Results

De cellevensvatbaarheid en de kwaliteit van gigaohm afdichting kritisch bij het bepalen van de kwaliteit van het cel aangesloten capaciteit opnamen. Daarom is het essentieel om een effectieve en efficiënte celkweek schaffen voor elektrofysiologische opnames, en typische levensvatbare cellen zijn geïllustreerd in figuur 1. Practice en tijd nuttig in het bereiken van een gigaohm zegel met hoge kwaliteit. Als men duidelijk kan zien celvervorming wanneer de patch pipet nadert de cel zoals beschreven in pr…

Discussion

-Cel bevestigd capacitieve metingen vereisen een aantal cruciale stappen om opnames met een hoge kwaliteit met succes te verkrijgen: 1) levensvatbare en gezonde cellen bereid uit bijnieren; 2) PDL coating van de dekglaasjes; 3) gigaohm afdichting formatie; 4) geluidsniveau van het systeem; en 5) fase correctie.

Voor dierlijke chirurgie, wijzigingen kan men mogelijk te maken is om de chirurgische benadering van de beste pak behendigheid te passen en om schade tijdens dissectie te voorkomen. D…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100mL
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Only thaw on ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Outer diameter-1.5 mm
			Inner diameter 1.10 mm
			Length- 10 cm