त्वरित फ्लोरोसेंट<em> बगल में</emएक्स गुणसूत्र निष्क्रियता में Histone संशोधन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस साथ Xist आरएनए कम्बाइंड के लिए> संकरण प्रोटोकॉल
Summary
We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.
Abstract
इम्यूनोफ्लोरेसेंस (इम्युनो-मछली) के साथ सीटू संकरण (मछली) में शाही सेना फ्लोरोसेंट संयोजन प्रोटीन, epigenetic संशोधनों और अन्य विवरण के स्थानीयकरण में एक साथ अंतर्दृष्टि के साथ शाही सेना स्थानीयकरण के स्थानिक गतिशीलता का पता लगाने के लिए एकल कोशिका के स्तर पर नियोजित किया जा सकता है कि एक तकनीक बनाता है जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस से प्रकाश डाला जा सकता है। एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता लंबे समय से गैर-कोडिंग आरएनए (lncRNA) मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने के लिए एक प्रतिमान है। स्तनधारी महिलाओं में दो एक्स क्रोमोसोम में से एक पर (एक Xist बादल कहा जाता है) एक्स निष्क्रिय विशिष्ट प्रतिलेख (Xist) lncRNA संचय एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता आरंभ करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। Xist शाही सेना सीधे या परोक्ष रूप से विभिन्न क्रोमेटिन संशोधित एंजाइमों के साथ सूचना का आदान प्रदान और निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र (ग्यारहवीं) के लिए अलग epigenetic परिदृश्य का परिचय। ग्यारहवीं में से एक में जाना जाता epigenetic बानगी histone H3 trimethyl-लाइसिन 27 (H3K27me3) संशोधन है। यहाँ, हम एक सरल और त्वरित इम्युनो-मछली का वर्णनXist शाही सेना के स्थानीयकरण और संबद्ध epigenetic संशोधनों की जांच करने के H3K27me3 की इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ युग्मित कई oligonucleotide जांच के साथ शाही सेना मछली का उपयोग कर Xist आरएनए का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल। Oligonucleotide जांच एक छोटी ऊष्मायन समय में परिणाम और इन विट्रो लिखित शाही सेना जांच (riboprobes) की तुलना में Xist शाही सेना के और अधिक संवेदनशील पता लगाने का उपयोग करना। इस प्रोटोकॉल lncRNAs की गतिशीलता और उसके संबंधित epigenetic संशोधन, chromatin संरचना, परमाणु संगठन और ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।
Introduction
स्तनधारी एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता (XCI) महिलाओं में दो एक्स क्रोमोसोम के एक transcriptionally एक निष्क्रिय है जिसमें XX और XY, के बीच एक्स से जुड़े जीन खुराक में असंतुलन के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए एक रणनीति है। एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता लंबे समय से गैर-कोडिंग आरएनए (lncRNA) अनुसंधान के लिए एक महान मॉडल प्रणाली है। एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता कई lncRNAs द्वारा नियंत्रित किया जाता है, और बड़े पैमाने पर lncRNAs, प्रतिलेखन, chromatin संरचना और परमाणु संगठन 2, 3 के बीच crosstalk तंत्र को उजागर करने के लिए पिछले कुछ दशकों में अध्ययन किया गया है।
एक्स गुणसूत्र पर स्थित एक्स निष्क्रियता केंद्र (XIC) गैर-कोडिंग RNAs के चार उत्पादन जीनों के एक नंबर के शामिल एक जटिल आनुवंशिक ठिकाना है। एक्स-निष्क्रिय विशिष्ट प्रतिलेख (Xist) lncRNA eutherian स्तनधारियों में एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता 5,6 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो एक ऐसे lncRNA है। Xist टेप फू के स्थान के चारों ओरसंरचना क्सी एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता आरंभ, और आरएनए मछली का उपयोग कल्पना जब एक बादल के रूप में प्रकट करने के लिए; इस गठन "Xist बादल" 7 के रूप में भेजा जाता है। Xist आरएनए विभिन्न क्रोमेटिन संशोधित एंजाइमों के साथ सूचना का आदान प्रदान के बाद से, चुप क्रोमेटिन और दमनकारी प्रतिलेखन के लिए अलग epigenetic संशोधनों के साथ Xist बादलों के सह स्थानीयकरण एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता 8 दौरान मनाया जाता है। उदाहरण के लिए, Xist आरएनए H3K27me3 के लिए जिम्मेदार है और एक दमनकारी क्रोमेटिन राज्य 9 लाती है जो polycomb दमनकारी जटिल 2 (PRC2) के साथ सूचना का आदान प्रदान। ग्यारहवीं और गहन H3K27me3 संशोधन के साथ अपने सह स्थानीयकरण पर Xist बादल की घटना क्सी 10,11 के एक ऐच्छिक heterochromatin परिदृश्य का प्रतिनिधित्व करता है।
इस तरह के डीएनए / आरएनए मछली के रूप में सितोगेनिक क तकनीक, बढ़ाया संवेदनशीलता और साथ हाल ही में और उन्नत तकनीकों को radiolabelled जांच 12 का उपयोग करते हुए पारंपरिक विधि से एक लंबा सफर तय किया हैकई oligonucleotide जांच 13,14 का उपयोग कर फ्लोरोसेंट इमेजिंग। इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ युग्मित डीएनए / आरएनए मछली नियमित spatiotemporal परमाणु संगठन, आरएनए स्थानीयकरण, chromatin संरचना और संशोधनों को समझने के लिए एक कोशिकाविज्ञान उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है। शाही सेना मछली के लिए सबसे मानक जांच तैयारी प्लाज्मिड या बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्र (बीएसी) क्लोन और निक अनुवाद या यादृच्छिक भड़काना 15 के साथ या तो उनके बाद लेबलिंग का इस्तेमाल शामिल है। हालांकि, चूहों में जीन का लगभग 70% और मनुष्यों में जीन का 40% भावना और एंटी-सेन्स टेप भेद करने के क्रम में इसलिए एक कतरा-विशिष्ट मछली विधि की आवश्यकता होती है, भावना और एंटी-सेन्स टेप 16 साल की एक ओवरलैप दिखाते हैं। इन विट्रो लिखित शाही सेना जांच (riboprobe ) अक्सर कतरा-विशिष्ट शाही सेना मछली 17,18 के लिए उपयोग किया जाता है; हालांकि, इस T7, SP6, या T3 प्रमोटर और synthesizing riboprobes साथ एक प्लाज्मिड क्लोन या पीसीआर उत्पाद की तैयारी शामिल है। इसके अलावा, genom से निकाली गई Riboprobesआईसी डीएनए या सीडीएनए अक्सर उच्च पृष्ठभूमि शोर में जो परिणाम गैर विशिष्ट क्षेत्रों और दोहराए तत्वों, होते हैं। एक और मुद्दा है, लंबाई में कुछ सौ न्यूक्लियोटाइड कर रहे हैं और कई fluorophores के होते हैं जो riboprobes, कुशलता नाभिक में घुसना नहीं कर सकते हैं। इस नाकाम करने के लिए, अंत में एक एकल फ्लोरोफोरे के साथ लेबल कई छोटे oligonucleotide जांच अच्छा संवेदनशीलता, वर्दी सिग्नल की शक्ति, और शुद्धि की आसानी और 14 से निपटने के लिए है कि विकसित किया गया है। इसके अलावा, डीएनए oligonucleotides के आम तौर पर शाही सेना की तुलना में अधिक स्थिर रहे हैं। हम एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता की प्रक्रिया के दौरान Xist lncRNA द्वारा प्रेरित क्सी की epigenetic गतिशीलता को समझने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस साथ Xist आरएनए मछली 19 में oligonucleotides के उपयोग करने का एक समान रणनीति लागू होता है। इस प्रोटोकॉल oligonucleotide जांच और कोशिकाओं की समुचित तैयारी के निर्माण के लिए, साथ ही इम्यूनोफ्लोरेसेंस और आरएनए मछली का उपयोग का वर्णन करता है। कई oligonucle का उपयोग कर Xist आरएनए मछलीXist आरएनए मछली एक प्रयोगशाला में नियमित तौर पर किया जाता है अगर otides लंबी अवधि में लागत प्रभावी तरीका है। इस तकनीक को एक साथ epigenetic संशोधन या कारकों के साथ अपने सह स्थानीयकरण मानचित्रण, जबकि कोशिकाओं में lncRNAs की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल के प्रमुख लाभ आसानी से एक अनुसंधान के हितों के अनुरूप करने के लिए इसे संशोधित करने की क्षमता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में, हम H3K27me3 के लिए स्लाइड तैयार करने, Xist आरएनए मछली, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस पूरा करने के लिए कम से कम 5 घंटा लेता है कि एक त्वरित इम्युनो-मछली प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। आमतौर पर शाही सेना मछली के लि…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hongjae Sunwoo for helpful advice for oligonucleotide design in RNA FISH. We also thank Serenity Curtis for editing the manuscript. N.Y. was supported by a Postdoctoral Fellowship for Research Abroad of the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). This work was supported by the NIH (RO1-GM102184), the March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), and the Developmental Fund and Trustee Grant at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center to Y.O.
Materials
| oligonucleotides with 5’-amine modification | IDT | |
| Alexa Fluor 488 Reactive Dye | Life Technologies | A32750 |
| MicroSpin G-25 columns | GE Healthcare | 27-5325-01 |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 |
| Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) | Roche | 10715859103 |
| Histone H3K27me3 antibody | Active Motif | 61017 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A21424 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36931 |
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