Fluorescente Rápida<em> In Situ</em> Protocolo de hibridación para Xist ARN combinado con inmunofluorescencia de histona Modificación de inactivación del cromosoma X.
Summary
We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.
Abstract
La combinación de ARN hibridación in situ fluorescente (FISH) con inmunofluorescencia (inmuno-FISH) crea una técnica que se puede emplear en el nivel de células individuales para detectar la dinámica espacial de la localización del ARN con la penetración simultánea en la localización de las proteínas, las modificaciones epigenéticas y otros detalles que puede ser resaltado mediante inmunofluorescencia. Inactivación del cromosoma X es un paradigma para largo ARN no codificante (lncRNA) mediada por silenciamiento génico. Transcripción específico (Xist) la acumulación lncRNA-X inactivo (llamado una nube de Xist) sobre uno de los dos cromosomas X en las hembras de mamíferos es un paso crítico para iniciar X-inactivación del cromosoma. ARN Xist interactúa directamente o indirectamente con diversas enzimas de la cromatina modificar y presenta distintos paisajes epigenéticos al cromosoma X inactivo (Xi). Una conocida seña de identidad de la epigenética Xi es la histona H3 trimetil-lisina 27 (H3K27me3) modificación. A continuación, describimos una forma sencilla y rápida inmuno-FISHProtocolo para la detección de Xist ARN utilizando ARN FISH con múltiples sondas de oligonucleótidos junto con inmunofluorescencia de H3K27me3 a examinar la localización de Xist ARN y modificaciones epigenéticas asociadas. El uso de sondas de oligonucleótidos resultados en un tiempo de incubación más corto y la detección más sensible de Xist ARN en comparación con el transcrito in vitro sondas de ARN (ribosondas). Este protocolo proporciona una poderosa herramienta para la comprensión de la dinámica de lncRNAs y su modificación epigenética asociada, la estructura de la cromatina, organización nuclear y la regulación transcripcional.
Introduction
Mamíferos inactivación del cromosoma X (XCI) es una estrategia para compensar el desequilibrio en la dosificación del gen ligado al cromosoma X entre XX y XY, en el que uno de los dos cromosomas X en las mujeres es transcripcionalmente inactiva 1. Inactivación del cromosoma X es un gran modelo para el sistema a largo ARN no codificante (lncRNA) investigación. Inactivación del cromosoma X está regulado por múltiples lncRNAs, y ha sido ampliamente estudiado en los últimos decenios para descubrir los mecanismos de diafonía entre lncRNAs, transcripción, estructura de la cromatina y la organización nuclear 2, 3.
El centro de la inactivación X (XIC), ubicado en el cromosoma X es un locus genético complejo compuesto de un número de genes que producen ARN no codificantes 4. -X inactivo transcripción específico (Xist) lncRNA en los mamíferos euterios es uno de esos lncRNA que desempeña un papel crucial en la inactivación del cromosoma X 5,6. Transcripciones Xist rodean la ubicación de la futura Xi para iniciar inactivación del cromosoma X, y aparece como una nube cuando se visualizan utilizando ARN FISH; esta formación se denomina como el "Xist nube" 7. Desde Xist ARN interactúa con varias enzimas de modificación de la cromatina, se observa co-localización de las nubes Xist con diferentes modificaciones epigenéticas de la cromatina y la transcripción en silencio durante represivo X-inactivación del cromosoma 8. Por ejemplo, Xist ARN interactúa con polycomb complejo represivo 2 (PRC2) que es responsable de H3K27me3 e induce un estado represivo cromatina 9. La aparición de la nube Xist en el Xi y su co-localización con la modificación intensiva H3K27me3 representa un paisaje heterocromatina facultativa de la Xi 10,11.
Técnicas citogenéticas, como el ADN / ARN FISH han recorrido un largo camino desde el método tradicional utilizando sondas radiomarcado 12 a las técnicas más recientes y avanzados con mayor sensibilidad yimágenes fluorescentes utilizando múltiples sondas de oligonucleótidos 13,14. ADN / ARN FISH junto con inmunofluorescencia se ha utilizado de forma rutinaria como una herramienta citológico de entender la organización espacio-temporal nuclear, la localización del ARN, la estructura de la cromatina y modificaciones. La preparación de la sonda estándar de la mayoría de ARN FISH implica el uso de plásmido o cromosoma artificial (BAC) clones bacterianos y su posterior etiquetado ya sea con la traducción nick o cebado aleatorio 15. Sin embargo, casi el 70% de los genes en ratones y 40% de los genes en los seres humanos muestran una superposición de sentido y antisentido transcripciones 16, por lo que requieren un método FISH específica de hebra a fin de distinguir sentido y antisentido transcripciones. In vitro sondas de ARN transcritos (ribosonda ) se utilizan a menudo para el capítulo específico de ARN FISH 17,18; sin embargo, esto implica la preparación de un clon de plásmido o producto de PCR con T7, SP6, o el promotor T3 y sintetizar ribosondas. Además, ribosondas derivado de genomaic ADN o ADNc a menudo contienen regiones no específicas y elementos repetitivos, que resultan en alto ruido de fondo. Otra cuestión es que ribosondas, que son unos pocos cientos de nucleótidos de longitud y contienen múltiples fluoróforos, no pueden penetrar de manera eficiente en el núcleo. Para evitar esto, múltiples sondas de oligonucleótidos más cortos marcados con un solo fluoróforo en el extremo han sido desarrollados que tienen una buena sensibilidad, potencia de la señal uniforme, y la facilidad de purificación y el manejo de 14. Además, los oligonucleótidos de ADN son generalmente más estable que el ARN. Se aplicó una estrategia similar de utilizar oligonucleótidos en Xist ARN FISH 19 con inmunofluorescencia para comprender la dinámica epigenéticas de la Xi inducidos por Xist lncRNA durante el proceso de inactivación del cromosoma X. Este protocolo describe la creación de sondas de oligonucleótidos y la preparación apropiada de las células, así como la utilización de inmunofluorescencia y ARN FISH. Xist ARN FISH utilizando múltiples oligonucleOtides es enfoque rentable en el largo plazo si Xist ARN FISH se realiza de forma rutinaria en el laboratorio de uno. Esta técnica se puede utilizar para identificar lncRNAs en las células mientras que la cartografía simultáneamente su co-localización con modificaciones o factores epigenéticos. Una ventaja importante del protocolo es la capacidad de modificar fácilmente para adaptarse a los propios intereses de investigación.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo, hemos presentado un protocolo de inmuno-FISH rápida que tarda menos de 5 horas para completar la preparación de diapositivas, Xist ARN FISH, y la inmunofluorescencia para H3K27me3. En comparación con el enfoque general de inmuno-FISH para Xist ARN de detección, que por lo general tiene una noche de incubación de ARN FISH, este protocolo no sólo reduce significativamente el tiempo pasado sino que también mejora la sensibilidad inmune-FISH usando sondas de oligonucleótidos.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hongjae Sunwoo for helpful advice for oligonucleotide design in RNA FISH. We also thank Serenity Curtis for editing the manuscript. N.Y. was supported by a Postdoctoral Fellowship for Research Abroad of the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). This work was supported by the NIH (RO1-GM102184), the March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), and the Developmental Fund and Trustee Grant at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center to Y.O.
Materials
| oligonucleotides with 5’-amine modification | IDT | |
| Alexa Fluor 488 Reactive Dye | Life Technologies | A32750 |
| MicroSpin G-25 columns | GE Healthcare | 27-5325-01 |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 |
| Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) | Roche | 10715859103 |
| Histone H3K27me3 antibody | Active Motif | 61017 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A21424 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36931 |
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