Fluorescent rapide<em> In Situ</em> Protocole hybridation pour ARN Xist combinée avec d'immunofluorescence Histone Modification dans inactivation du chromosome X
Summary
We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.
Abstract
Combinant ARN hybridation fluorescente in situ (FISH) avec immunofluorescence (immuno-FISH) crée une technique qui peut être utilisé au niveau de la cellule unique pour détecter les dynamiques spatiales de localisation d'ARN avec perspicacité simultanée dans la localisation de protéines, les modifications épigénétiques et autres détails qui peut être mis en évidence par immunofluorescence. Inactivation du chromosome X est un paradigme de longue ARN non codant (lncRNA) silençage génique médiée. transcrit spécifique (Xist) accumulation de lncRNA X-inactive (appelé un nuage Xist) sur l'un des deux chromosomes X chez les femelles-mammifères est une étape critique pour initier inactivation du chromosome X. ARN Xist interagit directement ou indirectement avec diverses enzymes de modification de la chromatine et introduit paysages épigénétiques distinctes au chromosome X inactif (Xi). Une des caractéristiques de l'épigénétique connu Xi est l'histone H3 lysine triméthyl-27 (H3K27me3) modification. Ici, nous décrivons un immuno-FISH simple et rapideprotocole pour la détection de l'ARN Xist en utilisant l'ARN FISH avec plusieurs sondes d'oligonucléotides couplés avec immunofluorescence de H3K27me3 d'examiner la localisation des ARN Xist et des modifications épigénétiques associées. Utilisant des sondes oligonucléotidiques se traduit par un temps d'incubation plus courte et une détection plus sensible de l'ARN Xist rapport au transcrit in vitro des sondes d'ARN (des ribosondes). Ce protocole fournit un outil puissant pour comprendre la dynamique de lncRNAs et sa modification épigénétique associé, la structure de la chromatine, organisation nucléaire et la régulation transcriptionnelle.
Introduction
Mammalian inactivation du chromosome X (XCI) est une stratégie pour compenser le déséquilibre de dosage de gène lié à l'X entre XX et XY, dans lequel l'un des deux chromosomes X chez les femelles est transcriptionnellement 1 inactivé. Inactivation du chromosome X est un système modèle très longtemps ARN non codant (lncRNA) recherche. Inactivation du chromosome X est réglementée par de multiples lncRNAs, et a été largement étudiée au cours des dernières décennies à découvrir les mécanismes de diaphonie entre lncRNAs, la transcription, la structure de la chromatine et l'organisation nucléaire 2, 3.
Le centre d'inactivation X (XIC) situé sur le chromosome X est un locus génétique complexe constitué d'un certain nombre de gènes qui produisent des ARN non codants 4. X-inactive transcrit spécifique (Xist) lncRNA chez les mammifères euthériens est un de ces lncRNA qui joue un rôle crucial dans inactivation du chromosome X 5,6. transcriptions de Xist entourent l'emplacement du future Xi pour lancer inactivation du chromosome X, et apparaît comme un nuage quand visualisées en utilisant l'ARN FISH; cette formation est appelé le "Xist Couverture" 7. Étant donné que l'ARN Xist interagit avec diverses enzymes de modification de la chromatine, la co-localisation des nuages Xist avec différentes modifications épigénétiques de la chromatine et la transcription silencieux répressif est observée au cours de l'inactivation du chromosome X-8. Par exemple, l'ARN Xist interagit avec polycomb complexe répressive 2 (PRC2) qui est responsable de H3K27me3 et induit un état de la chromatine répressive 9. L'apparition du nuage de Xist sur le Xi et son co-localisation avec la modification H3K27me3 intensive représente un paysage de hétérochromatine facultative du Xi 10,11.
Techniques cytogénétiques, comme l'ADN / ARN FISH ont parcouru un long chemin de la méthode traditionnelle en utilisant des sondes radiomarquées 12 aux techniques récentes et avancées avec une sensibilité accrue etl'imagerie de fluorescence en utilisant plusieurs sondes oligonucléotidiques 13,14. ADN / ARN FISH couplé avec immunofluorescence a été régulièrement utilisé comme un outil cytologique de comprendre l'organisation spatio-temporelle nucléaire, localisation d'ARN, la structure de la chromatine et modifications. La préparation de sonde la plus standard pour ARN FISH implique l'utilisation de plasmide ou de chromosomes artificiels (BAC) clones bactériens et leur étiquetage ultérieure soit avec translation de coupure ou amorçage aléatoire 15. Cependant, près de 70% des gènes chez la souris et 40% des gènes chez l'homme montrent un chevauchement des sens et antisens transcriptions 16, donc nécessitant une méthode de FISH spécifique de brin afin de distinguer sens et antisens transcriptions. In vitro des sondes d'ARN transcrits (ribosonde ) sont souvent utilisés pour spécifique de brin ARN FISH 17,18; Toutefois, il se agit de la préparation d'un clone de plasmide ou d'un produit PCR avec T7, SP6, ou le promoteur de T3 et ribosondes de synthèse. En outre, des ribosondes dérivé de génomeic ADN ou ADNc contiennent souvent des régions non-spécifiques et les éléments répétitifs, qui se traduisent par un bruit de fond élevé. Un autre problème est que ribosondes, qui sont à quelques centaines de nucléotides de long et contiennent plusieurs fluorophores, ne peuvent pas pénétrer efficacement dans le noyau. Pour éviter cela, plusieurs sondes oligonucléotidiques courtes marqués avec un fluorophore unique à la fin ont été développées qui ont une bonne sensibilité, la puissance du signal uniforme, et la facilité de purification et de manipulation 14. En outre, les oligonucleotides d'ADN sont généralement plus stables que les ARN. Nous avons appliqué une stratégie similaire en utilisant des oligonucléotides ARN Xist dans FISH 19 avec immunofluorescence de comprendre la dynamique de l'Xi épigénétiques induites par Xist lncRNA pendant le processus d'inactivation du chromosome X. Ce protocole décrit la création de sondes oligonucléotidiques et une bonne préparation des cellules, ainsi que l'utilisation de l'immunofluorescence et l'ARN FISH. ARN Xist FISH utilisant oligonucle multiplesotides est approche rentable à long terme si ARN Xist FISH est effectuée régulièrement dans son laboratoire. Cette technique peut être utilisée pour identifier lncRNAs dans les cellules tout en traçant simultanément son co-localisation avec des modifications ou des facteurs épigénétiques. Un avantage majeur du protocole est la possibilité de modifier facilement pour l'adapter à ses intérêts de recherche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous avons présenté un rapide protocole immuno-FISH qui prend moins de 5 h pour compléter la préparation des lames, ARN Xist FISH, et l'immunofluorescence pour H3K27me3. En comparaison avec l'approche générale immuno-FISH pour les ARN Xist détection, qui a généralement besoin d'une nuit d'incubation pour l'ARN FISH, ce protocole non seulement réduit considérablement le temps passé, mais améliore également la sensibilité du système immunitaire FISH utilisant des sonde…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hongjae Sunwoo for helpful advice for oligonucleotide design in RNA FISH. We also thank Serenity Curtis for editing the manuscript. N.Y. was supported by a Postdoctoral Fellowship for Research Abroad of the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). This work was supported by the NIH (RO1-GM102184), the March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), and the Developmental Fund and Trustee Grant at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center to Y.O.
Materials
| oligonucleotides with 5’-amine modification | IDT | |
| Alexa Fluor 488 Reactive Dye | Life Technologies | A32750 |
| MicroSpin G-25 columns | GE Healthcare | 27-5325-01 |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 |
| Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) | Roche | 10715859103 |
| Histone H3K27me3 antibody | Active Motif | 61017 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A21424 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36931 |
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