Veloce fluorescente<em> In Situ</em> Protocollo di ibridazione per Xist RNA combinata con immunofluorescenza di istone modifica in cromosoma X inattivazione
Summary
We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.
Abstract
Combinando RNA ibridazione in situ fluorescente (FISH) con immunofluorescenza (immuno-FISH) crea una tecnica che può essere impiegata a livello di singola cellula per rilevare la dinamica spaziale della localizzazione RNA con visione simultanea nella localizzazione delle proteine, modificazioni epigenetiche e altri dettagli che può essere evidenziato mediante immunofluorescenza. Inattivazione del cromosoma X è un paradigma per lungo RNA non codificante (lncRNA) mediata silenziamento genico. Trascrizione specifico (Xist) accumulo lncRNA X-inattiva (chiamato nuvola Xist) su uno dei due cromosomi X nelle femmine di mammifero è un passo fondamentale per avviare l'inattivazione del cromosoma X. Xist RNA direttamente o indirettamente interagisce con vari enzimi che modificano la cromatina e introduce distinti paesaggi epigenetici alla inattiva cromosoma X (Xi). Una nota caratteristica epigenetica del Xi è l'istone H3 trimetil-lisina 27 (H3K27me3) modifica. Qui, descriviamo un immuno-FISH semplice e veloceprotocollo per la rilevazione Xist RNA utilizzando RNA FISH con sonde multiple oligonucleotide accoppiato con immunofluorescenza di H3K27me3 per esaminare la localizzazione di Xist RNA e modificazioni epigenetiche associate. Utilizzando sonde oligonucleotidiche risultati in un tempo di incubazione più breve e la rilevazione più sensibile di Xist RNA rispetto alle sonde di RNA trascritto in vitro (ribosonde). Questo protocollo fornisce un potente strumento per comprendere le dinamiche di lncRNAs e la sua modificazione epigenetica associato, la struttura della cromatina, l'organizzazione nucleare e regolazione trascrizionale.
Introduction
Mammalian cromosoma X inattivazione (XCI) è una strategia per compensare lo squilibrio nel dosaggio del gene X-linked tra XX e XY, in cui uno dei due cromosomi X nelle femmine è trascrizionalmente inattivato 1. Inattivazione del cromosoma X è un ottimo sistema modello per lungo RNA non codificante (lncRNA) di ricerca. Inattivazione del cromosoma X è regolata da più lncRNAs, ed è stato ampiamente studiato negli ultimi decenni per scoprire i meccanismi di crosstalk tra lncRNAs, la trascrizione, la struttura della cromatina e l'organizzazione nucleare 2, 3.
Il centro X inattivazione (XIC) situato sul cromosoma X è un locus genetico complesso formato da un certo numero di geni che producono RNA non codificanti 4. X-inattiva trascrizione specifico (Xist) lncRNA nei mammiferi eutherian è uno di questi lncRNA che svolge un ruolo cruciale nel cromosoma X inattivazione 5,6. Trascrizioni Xist circondano la posizione del future Xi per avviare inattivazione del cromosoma X, e appaiono come una nuvola quando visualizzato utilizzando RNA FISH; questa formazione è denominato "Xist Cloud" 7. Dal Xist RNA interagisce con vari enzimi che modificano la cromatina, co-localizzazione delle nuvole Xist con diverse modificazioni epigenetiche per cromatina silente e trascrizione repressiva si osserva durante cromosoma X inattivazione 8. Ad esempio, Xist RNA interagisce con Polycomb complesso repressione 2 (PRC2) che è responsabile per H3K27me3 e induce uno stato cromatina repressione 9. Il verificarsi della nuvola Xist sul Xi e la sua co-localizzazione con la modifica intensiva H3K27me3 rappresenta un paesaggio eterocromatina facoltativa del Xi 10,11.
Tecniche di citogenetica, come il DNA / RNA FISH hanno percorso una lunga strada dal metodo tradizionale utilizzando sonde radiomarcate 12 alle tecniche più recenti e avanzate con maggiore sensibilità eimmagini fluorescenti utilizzando più sonde oligonucleotidiche 13,14. DNA / RNA FISH accoppiato con immunofluorescenza è stato regolarmente utilizzato come strumento citologico per comprendere l'organizzazione spazio-temporale nucleare, localizzazione RNA, la struttura della cromatina e modifiche. La preparazione sonda più standard per RNA FISH implica l'uso di plasmide o cromosomiche artificiale (BAC) cloni batterici e la loro successiva etichettatura o con traduzione nick o adescamento casuali 15. Tuttavia, quasi il 70% dei geni nei topi e il 40% dei geni nell'uomo mostrano una sovrapposizione di senso e antisenso trascrizioni 16, quindi richiede un metodo FISH specifico strand per distinguere senso e antisenso trascrizioni. In vitro sonde RNA trascritti (riboprobe ) sono spesso utilizzati per specifici filamento di RNA FISH 17,18; Tuttavia, ciò comporta la preparazione di un clone plasmidico o prodotti di PCR con T7, SP6, T3 o promotore e riboprobes sintetizzare. Inoltre, ribosonde derivato da genomic DNA o cDNA contengono spesso regioni non-specifici e gli elementi ripetitivi, che si traducono in alto rumore di fondo. Un altro problema è che riboprobes, che sono a poche centinaia di nucleotidi di lunghezza e contengono più fluorofori, non possono penetrare efficacemente nel nucleo. Per aggirare questo, più sonde oligonucleotidiche marcate con brevi un unico fluoroforo alla fine sono stati sviluppati che hanno una buona sensibilità, potenza del segnale uniforme, e la facilità di purificazione e movimentazione 14. Inoltre, gli oligonucleotidi di DNA sono generalmente più stabile di RNA. Abbiamo applicato una simile strategia di utilizzo di oligonucleotidi in Xist RNA FISH 19 con immunofluorescenza per comprendere le dinamiche epigenetici del Xi indotte da Xist lncRNA durante il processo di inattivazione del cromosoma X. Questo protocollo descrive la creazione di sonde oligonucleotidiche e corretta preparazione di cellule, così come l'utilizzo di immunofluorescenza e RNA FISH. Xist RNA FISH utilizzando oligonucle multiplaotides è economicamente efficiente nel lungo termine se Xist RNA FISH viene eseguita di routine nel proprio laboratorio. Questa tecnica può essere utilizzata per identificare lncRNAs nelle cellule e contemporaneamente mappatura sua co-localizzazione con modificazioni epigenetiche o fattori. Uno dei principali vantaggi del protocollo è la capacità di modificare facilmente per soddisfare i propri interessi di ricerca.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo lavoro, abbiamo presentato una rapida protocollo immuno-FISH, che richiede meno di 5 ore per completare la preparazione vetrino, Xist RNA FISH, e immunofluorescenza per H3K27me3. In confronto con l'approccio generale immuno-FISH per Xist RNA rilevazione, che di solito ha bisogno di incubazione durante la notte per l'RNA FISH, questo protocollo non solo riduce significativamente il tempo trascorso, ma migliora anche la sensibilità di immuno-FISH con sonde oligonucleotidi.
P…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hongjae Sunwoo for helpful advice for oligonucleotide design in RNA FISH. We also thank Serenity Curtis for editing the manuscript. N.Y. was supported by a Postdoctoral Fellowship for Research Abroad of the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). This work was supported by the NIH (RO1-GM102184), the March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), and the Developmental Fund and Trustee Grant at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center to Y.O.
Materials
| oligonucleotides with 5’-amine modification | IDT | |
| Alexa Fluor 488 Reactive Dye | Life Technologies | A32750 |
| MicroSpin G-25 columns | GE Healthcare | 27-5325-01 |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 |
| Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) | Roche | 10715859103 |
| Histone H3K27me3 antibody | Active Motif | 61017 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A21424 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36931 |
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