siRNA를 치료제의 전달을위한 다공성 실리콘 미세 입자
Summary
배달은 작은 간섭 RNA (siRNA의)의 치료 구현을위한 주요 과제로 남아. 이 프로토콜은 아르기닌 및 폴리에틸렌 이민 다공성 실리콘 그래프트 미립자로 구성된 다기능 및 생체 적합성의 siRNA 전달 플랫폼의 사용을 포함한다.
Abstract
Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.
Introduction
작은 방해 RNA들 (siRNA가)는 유전자의 발현을 억제 할 수있는 이중 가닥 RNA 분자이다. 최근, siRNA는 임상 응용 1-5하는데있어서의 장래의 사용을 위해 치료 가능성을 보여 바이오 의약품의 차세대로서 개발되어왔다. 그러나, siRNA의 치료의 성공적인 구현 인해 클레아 불량 세포 내 흡수, 낮은 형질 감염 효율 및 엔도 / 5 리소좀에서 비효율적 릴리스 저하, 상당한 도전 남아있다. 이러한 장애의 대부분은 안전하고 효율적으로 환부 조직으로 siRNA를 전달을 제공 할 수있는 플랫폼의 개발에 의해 극복 될 수있다. 바이러스 캐리어에 비해 비 바이러스 플랫폼은 안전, 저가 및 원단의 용이성 등 여러 가지 이점을 제공한다. 이러한 폴리머 및 지질 등의 특정 성, 양이온 성 나노 입자에서, siRNA를 전달 3 유용 증명했다.
이전에, 우리는 원반형 닥터 개발전달 시스템 UG, 다단 벡터 (MSV)를 불린다. 이 플랫폼은 하나가 다른 차량으로부터 방출되는 연속 한 단계에 기초한다. 두번째 단계 차량 약물이나 조영제 -6,7- 로케이션 나노 입자 인 반면 제 1 스테이지 차량 생분해 다공성 실리콘 (PSI)에서 만든 미립자이다. 시 8 저하로 PSI 재료에 포함 된 나노 입자는, 서서히 방출된다. 실리콘 입자를 사용하는 이점은 형태 및 표면 특성을 용이하게 최적의 생체 내 분포 및 약물 방출을 달성하기 위해 맞추어 질 수 있다는 것이다. 최근에, 종양 조직에 대한 siRNA를 리포좀의 배달 MSV 플랫폼의 성공적인 사용은 난소 및 유방암 마우스 모델 9,도 10에 도시 하였다.
이 작품에서 우리는 MSV 플랫폼의 원칙에 따라 siRNA를위한 보편적 인 전달 시스템을 제작했다. 본 전달 시스템의 효능은 이전 우릴 입증되었다다른의 siRNA를 보내고 11 개의 분자. 시스템은 폴리에틸렌 이민 (PEI) 및 아르기닌 (의 Arg)로 이루어지는 그래프트 PSI, 폴리 양이온 기능화 된 다공성 실리콘 (PCPS) 담체이다. , 여기서 Arg 및 PSI는 PEI의 독성을 감소시키는 역할을 할 수있는 동안 이전 11 demonstarted로 PEI는 siRNA 로의 정전 기적 상호 작용을 형성하는데 도움을 줄 수있다. PSI 미립자 siRNA를 보호 및 지속 방출을 가능하게하면서 또한, PEI의 존재는 세포 내 흡수 및 엔도 좀 탈출 어시스트 할 수있다. PSI 입자 서서히함으로써 뚜렷한 형태 및 좁은 크기 분포를 갖고 11의 Arg-PEI / siRNA의 나노 입자 (도 1)의 형성의 결과로, 생리적 조건 하에서 분해. PCPS / siRNA의 시스템의 안정성에 관한 자세한 내용은 쉔 등. (11)에 의해 연구를 참조하시기 바랍니다. 두번째 단계의 나노 입자가 초기 prese 나지 않으므로 PCPS 플랫폼은, 종래 MSV 상이1 단 캐리어 (11), (12), NT 퇴화 캐리어하지만 시간에 걸쳐 형성된다. PCPS 시스템의 siRNA의 적재 효율, 세포 독성 유전자 침묵 효율이 시험관 내에서 평가되었다. 형질 전환 효율은 DNA 복구에 관여하는 10 (ATM) 종양 유전자 돌연변이 실조증 확장증 대해 siRNA를 이용하여 측정 하였다. 이전에는, ATM의 억제는 유방암 모델 (10)에서 종양 성장을 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 세포로의 siRNA의 형질 감염과 성공적으로 전달하기위한 방법을 설명한다. 특히,의 siRNA 전달 폴리 양이온 – 작용 PSI 입자로 구성된 다기능 플랫폼을 사용함으로써 달성된다. siRNA의 치료의 사용은 여러 종양 유전자가 높은 특이성으로 타겟팅 할 수있는 큰 잠재력 예, 암 치료를 갖는다. 따라서, siRNA의 치료 문제를 완화 할 수있는 siRNA를 전달 비히클을 개발할 필요가 존재한다. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from Houston Methodist Research Institute, the National Natural Science Foundation of China (Nos., 21231007 and 21121061), the Ministry of Education of China (Nos., 20100171110013 and 313058), the National Basic Research Program of China (973 Program No. 2014CB845604), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company/Institution | Catalog Number | Comments/Description |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10X Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10 X Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1X solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4X) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100X) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1X |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blor |
| 6X TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent. | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10cm) dia., 5x7mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (hight), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
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