Isoler Potentiated Hsp104 Variantes utilisant de la levure Proteinopathy modèles

Summary

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Abstract

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Introduction

Levure de modèles proteinopathy ont été développés pour les troubles du repliement des protéines, y compris la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la maladie (PD) ^3/1 de Parkinson. L'expression des protéines TDP-43 et FUS, qui misfold chez les patients SLA, sont toxiques et mislocalize à former des agrégats cytoplasmiques dans la levure ^1,2. De même, l'expression d'α-synucléine (α-syn), qui est impliquée dans la MP, est toxique et mislocalizes à former des agrégats cytoplasmiques de levure ^3. Ces caractéristiques récapitulent phénotypes chez les patients atteints de ces troubles ^4,5. Ainsi, les modèles de levure fournissent une plate-forme utile pour le criblage de protéines ou de petites molécules qui empêchent ou inverser ces phénotypes ^2,6-13. Nous sommes intéressés par le développement de protéines qui sont capables de renverser l'agrégation et la toxicité due à TDP-43, FUS, et α-syn. Nous nous concentrons sur Hsp104, un AAA + protéines de la levure qui est uniquement capable de désagréger la fois des protéines fragrégats amorphes l'OM et l'amyloïde dans la levure, mais il n'a pas homologue humain ^14,15. Hsp104 est finement réglé pour désagréger les prions de levure endogènes et ne dispose que d'une capacité limitée à ventiler substrats impliqués dans les maladies neurodégénératives humaines, qu'il rencontre jamais normalement ^16,17. Ainsi, nous avons pour objectif de concevoir des versions améliorées de Hsp104 qui sont en mesure de ventiler efficacement ces substrats humains. Pour ce faire, nous construisons les grandes bibliothèques de variantes Hsp104 par PCR sujette à l'erreur; Ces bibliothèques peuvent être contrôlés au moyen des modèles de levure proteinopathy ^17. Nous avons adopté une approche de domaine ciblé pour la construction et le criblage de banques, comme Hsp104 est très grand ^17. Nous avons d'abord mis l'accent sur ​​le domaine du milieu (MD) de Hsp104 ^17, même si les approches similaires peuvent être utilisés pour dépister d'autres domaines. Ces modèles permettent de cribler l'activité de disaggregase directement, par opposition à d'autres techniques telles que l'affichage de la surface, qui est le reposricted à utiliser pour la surveillance de la liaison ^18.

Notre protocole est basé sur deux étapes de criblage (Figure 1). Tout d'abord, Hsp104 variantes qui suppriment la toxicité du substrat de la maladie chez la levure sont sélectionnées. Pour ce faire, le Hsp104 variantes et associée à la maladie substrat sont cotransformé dans Δ Hsp104 levure. Nous employons Δ Hsp104 levure à explorer Hsp104 espace de séquence en l'absence de type sauvage (WT) Hsp104 ^17. Fait important, la deletion de Hsp104 n'a pas d'incidence α-syn, FUS, ou TDP-43 toxicité dans la levure, et l'expression de Hsp104 ^WT prévoit un minimum de sauvetage ^1,13,17. La levure est ensuite étalé sur des milieux induisant pour induire l'expression des deux protéines. Levure hébergeant Hsp104 variantes qui suppriment la toxicité de la croissance de la colonie confèrent substrat associé à une maladie. Ces variantes sont sélectionnées pour une analyse plus approfondie, tandis que le maintien de colonies variantes qui ne suppriment pas la toxicité dé. Cependant,les faux positifs sont un problème important dans cet écran. L'expression de TDP-43, FUS, et α-syn sont hautement toxiques, ce qui crée une forte pression de sélection pour l'apparition de suppresseurs génétiques spontanées de toxicité sans rapport avec la variante Hsp104 être exprimé. Ainsi, nous avons utilisé un écran secondaire qui est aussi relativement haut débit pour éliminer ces suppresseurs de toxicité non spécifiques ^17. Dans cet écran secondaire, levures sélectionnées sont traités avec 5 Fluorootic acide (5-FOA) pour contrer sélection pour le plasmide Hsp104 ^19. Les souches sont ensuite évaluées pour substrat (TDP-43, FUS, ou α-syn) toxicité par analyse des taches de sorte que la toxicité du substrat est rétablie après la perte du plasmide Hsp104. Ainsi, la levure, dans lequel la toxicité est restaurée dans l'écran secondaire affiche initialement doute suppression de la toxicité due à la présence du variant Hsp104. Ces levures sont désignés comme «hits» et le plasmide Hsp104 devrait alors êtrerécupérée et séquences pour identifier les mutations dans le gène Hsp104 ¹⁷ (figure 1). Les résultats doivent ensuite être confirmées par la construction de la mutation indépendamment en utilisant la mutagenèse dirigée et retester pour la suppression de toxicité alors. Les applications potentielles de ce protocole sont larges. En utilisant ces procédés, des banques de tout type de protéine peuvent être criblés pour des variantes qui suppriment la toxicité d'une protéine substrat qui est toxique à la levure.

Protocol

1. Bibliothèque génération Pour construire des banques de Hsp104 utilisant la PCR sujette à l'erreur spécifique au domaine, d'abord amplifier le domaine d'intérêt avec une erreur de l'ADN polymérase 20 sujets. On purifie le produit de PCR par extraction sur gel. Effectuez une étape d'extension de méga-utilisant un protocole de mutagenèse dirigée norme: combiner 50 ng modèle plasmide, 250 ng méga-200 uM de dNTP, et haute-fidélité ADN polyméras…

Representative Results

Nous avons construit une banque de variants Hsp104 randomisés dans le domaine intermédiaire et criblés pour la suppression de TDP-43 toxicité. La bibliothèque a été transformée et plaqué sur du glucose et du galactose plaques (figure 2) pour évaluer la rigueur de l'écran. Des colonies isolées ont été sélectionnés et les souches ont été sélectionnées à l'aide contre 5-FOA pour éliminer le plasmide Hsp104. Ces souches ont ensuite été évalués pour confirmer que la toxicit?…

Discussion

Ici, nous présentons notre approche pour isoler variantes Hsp104 potentialisés qui suppriment la toxicité des substrats associés à la maladie en utilisant des modèles de levure proteinopathy. En utilisant cette approche, les grandes banques de variants peuvent être criblés en haut débit, avec la seule limitation étant le nombre de variantes qui passent l'écran secondaire 5-FOA. En effectuant ces mesures au format 96 puits, nous contrôlons régulièrement jusqu'à 200 coups à la fois dans l'étap…

Materials

Table of Specific Materials/Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
150mm Petri dishes	Falcon	351058
5-Fluorootic Acid	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2mL Plates	Eppendorf	0030 502.302
96 bold replicator tool	V&P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200