Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.
Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.
खमीर proteinopathy मॉडल amyotrophic पार्श्व काठिन्य (ए एल एस) और पार्किंसंस रोग (पीडी) 1-3 सहित प्रोटीन-misfolding विकारों के लिए विकसित किया गया है. ए एल एस रोगियों में misfold जो प्रोटीन तेदेपा-43 और FUS, की अभिव्यक्ति, खमीर 1,2 में cytoplasmic समुच्चय के लिए फार्म विषाक्त और mislocalize हैं. इसी तरह, पीडी में फंसा है जो α-synuclein (α-SYN), की अभिव्यक्ति, विषाक्त है और mislocalizes खमीर 3 में cytoplasmic समुच्चय के रूप में. इन सुविधाओं को इन विकारों 4,5 के साथ रोगियों में phenotypes पुनरावृत्ति. इस प्रकार, खमीर मॉडल को रोकने या इन phenotypes 2,6-13 रिवर्स कि प्रोटीन या छोटे अणुओं के लिए स्क्रीनिंग के लिए एक उपयोगी मंच प्रदान करते हैं. हम कारण तेदेपा-43, FUS, और α-syn करने के एकत्रीकरण और विषाक्तता पीछे करने में सक्षम हैं कि प्रोटीन के विकास में रुचि रखते हैं. हम Hsp104, दोनों fr प्रोटीन disaggregating के विशिष्ट सक्षम है कि खमीर से एक एएए + प्रोटीन पर ध्यान केंद्रितखमीर में ओम अनाकार समुच्चय और amyloid, अभी तक यह कोई मानव सजात 14,15 है. Hsp104 सूक्ष्मता अंतर्जात खमीर prions disaggregate को देखते हैं और यह आमतौर पर 16,17 मुठभेड़ों कभी नहीं जो मानव neurodegenerative रोगों में फंसा substrates के disaggregate के लिए ही सीमित क्षमता है. इस प्रकार, हम प्रभाव के साथ इन मानव substrates के disaggregate करने में सक्षम हैं कि Hsp104 का परिष्कृत संस्करण इंजीनियर का लक्ष्य. Hsp104 त्रुटि प्रवण पीसीआर का उपयोग वेरिएंट की ऐसा करने के लिए, हम बड़े पुस्तकालयों का निर्माण; इन पुस्तकालयों खमीर proteinopathy मॉडल 17 का उपयोग कर जांच की जा सकती है. Hsp104 17 बहुत बड़ी है, जैसा कि हम पुस्तकालयों का निर्माण और स्क्रीनिंग के लिए एक डोमेन-लक्षित दृष्टिकोण अपनाया है. इसी दृष्टिकोण अन्य डोमेन स्क्रीन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, हालांकि हम शुरू में, बीच डोमेन Hsp104 17 का (एमडी) पर ध्यान केंद्रित किया. इस तरह बाकी है जो सतह प्रदर्शन, के रूप में वैकल्पिक तकनीकों के लिए विरोध के रूप में इन मॉडलों, सीधे disaggregase गतिविधि के लिए स्क्रीनिंग सक्षम18 बाध्यकारी निगरानी के लिए उपयोग करने के लिए ricted.
हमारी प्रोटोकॉल दो स्क्रीनिंग कदम (चित्रा 1) पर आधारित है. सबसे पहले, खमीर में रोग सब्सट्रेट की विषाक्तता को दबाने कि Hsp104 वेरिएंट चयनित हैं. ऐसा करने के लिए, Hsp104 वेरिएंट और रोग-जुड़े सब्सट्रेट Δ hsp104 खमीर में cotransformed रहे हैं. हम जंगली प्रकार की अनुपस्थिति (डब्ल्यूटी) Hsp104 17 में Hsp104 अनुक्रम अंतरिक्ष का पता लगाने के लिए Δ hsp104 खमीर रोजगार. महत्वपूर्ण बात है, Hsp104 का विलोपन खमीर में α-syn, FUS, या तेदेपा-43 विषाक्तता को प्रभावित नहीं करता, और Hsp104 गुम्मट की अभिव्यक्ति न्यूनतम बचाव 1,13,17 प्रदान करता है. खमीर तो दोनों प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए मीडिया उत्प्रेरण पर चढ़ाया जाता है. कॉलोनी की बीमारी से जुड़े सब्सट्रेट प्रदान विकास की विषाक्तता को दबाने कि Hsp104 वेरिएंट शरण खमीर. कालोनियों विषाक्तता मरने को दबाने नहीं है कि वेरिएंट को बनाए रखते हुए ये वेरिएंट, आगे के विश्लेषण के लिए चुने गए हैं. हालांकि,झूठी सकारात्मक इस स्क्रीन में एक पर्याप्त समस्या हैं. तेदेपा-43, FUS, और α-syn की अभिव्यक्ति व्यक्त की जा रही Hsp104 संस्करण के लिए असंबंधित विषाक्तता का सहज आनुवंशिक दमन की उपस्थिति के लिए एक मजबूत चयनात्मक दबाव बनाता है, जो बेहद जहरीला कर रहे हैं. इस प्रकार, हम भी इन अविशिष्ट विषाक्तता दमन 17 को खत्म करने के लिए अपेक्षाकृत उच्च throughput है कि एक माध्यमिक स्क्रीन का इस्तेमाल किया है. इस माध्यमिक स्क्रीन में, चयनित खमीर Hsp104 प्लाज्मिड 19 के लिए चयन का मुकाबला करने के लिए 5-Fluorootic एसिड (5 FOA) के साथ व्यवहार कर रहे हैं. स्ट्रेन तो सब्सट्रेट की विषाक्तता Hsp104 प्लाज्मिड के नुकसान के बाद बहाल है कि यह सुनिश्चित करने के लिए परख खोलना के माध्यम से (तेदेपा-43, FUS, या α-SYN) विषाक्तता सब्सट्रेट के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं. इस प्रकार, विषाक्तता इस माध्यमिक स्क्रीन में बहाल है जिसमें खमीर शायद मूल कारण Hsp104 संस्करण की उपस्थिति के लिए विषाक्तता दमन का प्रदर्शन किया. ये खमीर 'हिट' के रूप में नामित कर रहे हैं और Hsp104 प्लाज्मिड तो होना चाहिएबरामद और Hsp104 जीन 17 (चित्रा 1) में उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए अनुक्रम. किसी भी हिट तो विषाक्तता दमन के लिए retesting तो स्वतंत्र रूप से उत्परिवर्तन निर्माण साइट निर्देशित mutagenesis के उपयोग करते हुए और से reconfirmed किया जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल के लिए आवेदन संभावित व्यापक हैं. इन विधियों का प्रयोग, प्रोटीन के किसी भी प्रकार के पुस्तकालयों खमीर में विषाक्त है कि किसी भी सब्सट्रेट प्रोटीन की विषाक्तता को दबाने कि वेरिएंट के लिए जांच की जा सकती है.
यहाँ हम खमीर proteinopathy मॉडल का उपयोग कर रोग से जुड़े substrates की विषाक्तता को दबाने कि potentiated Hsp104 वेरिएंट को अलग करने के लिए हमारे दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, वेरिएंट के बड़े पुस्तकालयों के?…
The authors have nothing to disclose.
We thank Sue Lindquist, Aaron Gitler, and Martin Duennwald for kindly sharing reagents. Our studies were supported by: an American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); NIH Director’s New Innovator Award DP2OD002177, NIH grants R21NS067354, R21HD074510, and R01GM099836, a Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), Packard Center for ALS Research at Johns Hopkins University, Target ALS, and an Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).
Table of Specific Materials/Equipment | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
150mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
96-DeepWell 2mL Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |