Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.
Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.
Дрожжи модели proteinopathy были разработаны для белок-неправильного сворачивания расстройств, включая боковой амиотрофический склероз (ALS) и болезнь Паркинсона (PD) 1-3. Экспрессия белков TDP-43 и FUS, которые misfold у пациентов с БАС, являются токсичными и mislocalize с образованием агрегатов цитоплазматические в дрожжах 1,2. Аналогично, выражение α-синуклеина (α-син), который участвует в PD, является токсичным и mislocalizes с образованием агрегатов цитоплазматические в дрожжах 3. Эти особенности резюмировать фенотипы у больных с этими расстройствами 4,5. Таким образом, модели дрожжей обеспечить полезную платформу для скрининга белков или малых молекул, которые предотвратить или обратить вспять эти фенотипы 2,6-13. Мы заинтересованы в развитии белков, которые способны перевернуть агрегацию и токсичность из-за TDP-43, FUS, и α-син. Мы делаем ставку на Hsp104, в AAA + белка из дрожжей, который однозначно способен разбивке белки и птOM аморфные агрегаты и амилоида в дрожжах, пока это не имеет никакого человеческий гомолог 14,15. Hsp104 тонко настроенный разбить эндогенные дрожжевых прионов и имеет лишь ограниченную способность разбить субстраты, причастных к нейродегенеративных заболеваний человека, которые он никогда не обычно сталкивается 16,17. Таким образом, мы стремимся инженер расширенные версии Hsp104, которые способны действенно детализировать эти человеческие субстраты. Чтобы сделать это, мы строим большие библиотеки из Hsp104 варианты использования ошибкам ПЦР; эти библиотеки могут быть подвергнуты скринингу с использованием моделей дрожжи proteinopathy 17. Мы приняли домена целевой подход к построению и скрининга библиотек, как Hsp104 очень большой 17. Мы изначально была ориентирована на средней области (MD) из Hsp104 17, при том, что аналогичные подходы могут быть использованы для скрининга других доменов. Эти модели позволяют скрининг на disaggregase активности непосредственно, в отличие от альтернативных способов, таких как поверхности дисплея, который является Остальноеricted использовать для мониторинга связывания 18.
Наш протокол базируется на двух шагов скрининга (рисунок 1). Во-первых, варианты Hsp104, которые подавляют токсичность болезни подложки в дрожжах выбраны. Чтобы сделать это, Hsp104 варианты и болезни, связанные подложка котрансформировали в Δ Hsp104 дрожжей. Мы используем Δ Hsp104 дрожжей, чтобы исследовать последовательности пространство Hsp104 в отсутствие дикого типа (WT) Hsp104 17. Важно отметить, что удаление Hsp104 не влияет α-син, FUS или TDP-43 токсичность в дрожжах, и выражение Hsp104 WT обеспечивает минимальное спасение 1,13,17. Дрожжи затем высевали на средств индукции, чтобы индуцировать экспрессию обоих белков. Дрожжей, несущих варианты Hsp104, которые подавляют токсичность заболеваний, ассоциированных роста подложки придают колонии. Эти варианты отобраны для дальнейшего анализа, в то время как колонии поддержания варианты, которые не подавляют токсичности кубик. Тем не менее,ложные срабатывания существенной проблемой в этом экране. Выражение TDP-43, FUS, и α-син являются высокотоксичными, которая создает сильное селективное давление для возникновения спонтанных генетических супрессоров токсичности, не связанной с вариантом Hsp104 выражается. Таким образом, мы использовали среднее экран, который также сравнительно высокая пропускная устранить эти неспецифические супрессоры токсичности 17. В этом вторичном экране, выбранный дрожжи обрабатывают 5-Fluorootic кислоты (5-FOA), чтобы противостоять выберите для Hsp104 плазмиды 19. Штаммы затем оценивали на подложке (TDP-43, FUS, или α-син) токсичность через пятнистость анализа, чтобы гарантировать, что токсичность подложки восстанавливается после потери плазмиды Hsp104. Таким образом, дрожжи, в которых токсичность восстанавливается в этом вторичном экране по-видимому, первоначально отображается подавление токсичность из-за присутствия в варианте Hsp104. Эти дрожжи обозначаются как "хитов" и плазмиды Hsp104 должны затем бытьвосстановлены и последовательность, чтобы определить мутации в Hsp104 ген 17 (рисунок 1). Любые удары должны быть подтверждена путем построения мутацию независимо с помощью сайт-направленного мутагенеза, а затем повторное тестирование для подавления токсичности. Потенциальные приложения для этого протокола широки. С помощью этих методов, библиотеки любого типа белка может быть подвергнуты скринингу на вариантах, которые подавляют токсичность любой подложки белком, который является токсичным в дрожжах.
Здесь мы представляем наш подход к изоляции потенцированные варианты Hsp104, которые подавляют токсичность, ассоциированных с заболеваниями подложек с использованием моделей дрожжи proteinopathy. Используя этот подход, большие библиотеки вариантов может быть показан в высокой пропускной спо…
The authors have nothing to disclose.
We thank Sue Lindquist, Aaron Gitler, and Martin Duennwald for kindly sharing reagents. Our studies were supported by: an American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); NIH Director’s New Innovator Award DP2OD002177, NIH grants R21NS067354, R21HD074510, and R01GM099836, a Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), Packard Center for ALS Research at Johns Hopkins University, Target ALS, and an Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).
Table of Specific Materials/Equipment | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
150mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
96-DeepWell 2mL Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |