Isolera förstärkas Hsp104 Varianter Använda Jäst Proteinopathy modeller

Summary

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Abstract

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Introduction

Jäst proteinopathy modeller har utvecklats för protein misfolding sjukdomar inklusive amyotrofisk lateralskleros (ALS) och Parkinsons sjukdom (PD) ^1-3. Uttrycket av proteinerna TDP-43 och FUS, som misfold i ALS-patienter, är giftiga och mislocalize att bilda cytoplasmiska aggregat i jäst ^1,2. På liknande sätt uttrycket av α-synuklein (α-syn), som är inblandad i PD, är giftig och mislocalizes att bilda cytoplasmiska aggregat i jäst ^3. Dessa funktioner rekapitulera fenotyper hos patienter med dessa sjukdomar ^4,5. Således, jäst modeller ger en användbar plattform för screening för proteiner eller små molekyler som hindrar eller vända dessa fenotyper ^2,6-13. Vi är intresserade av utvecklingen av proteiner som kan vända aggregering och toxicitet på grund av TDP-43, FUS, och α-syn. Vi fokuserar på Hsp104, ett AAA + protein från jäst som är unikt kapabel att disaggregerar proteiner både frOM amorfa aggregat och amyloid i jäst, men det har ingen mänsklig homolog ^14,15. Hsp104 är finstämt för att dela upp endogena jäst prioner och har endast begränsad möjlighet att dela upp substrat inblandade i mänskliga neurodegenerativa sjukdomar, som det aldrig normalt stöter ^16,17. Därför strävar vi efter att konstruera förbättrade versioner av Hsp104 som kan efficaciously dela upp dessa mänskliga substrat. För att göra det, vi bygger stora bibliotek av Hsp104 varianter använder felbenägen PCR; dessa bibliotek kan screenas med hjälp av jäst proteinopathy modellerna ^17. Vi har antagit ett domän målinriktad strategi för att konstruera och screena bibliotek, eftersom Hsp104 är mycket stor ^17. Vi fokuserade inledningsvis på mitten domän (MD) av Hsp104 ^17, även om liknande metoder kan användas för att screena andra domäner. Dessa modeller möjliggör screening för disaggregase aktivitet direkt, till skillnad från alternativa tekniker såsom yta display, som är restenricted att använda för att övervaka bindning ^18.

Vår Protokollet är baserat på två screeningsteg (figur 1). Först är Hsp104 varianter som hämmar toxicitet av sjukdomen substratet i jäst vald. För att göra detta, varianter av Hsp104 och sjukdomsassocierade substrat samtrans i Δ hsp104 jäst. Vi använder Δ hsp104 jäst att utforska Hsp104 sekvens utrymme i frånvaro av vildtyp (WT) Hsp104 ^17. Viktigt är radering av Hsp104 inte påverka α-syn, FUS eller TDP-43 toxicitet i jäst, och uttryck av Hsp104 ^WT ger minimal räddning ^1,13,17. Jästen plattströks sedan på inducerande media för att inducera expression av båda proteinerna. Jäst härbärge Hsp104 varianter som hämmar toxicitet sjukdomsassocierade substrat confer tillväxten av kolonin. Dessa varianter väljs för vidare analys, medan kolonier bibehålla varianter som inte hämmar toxicitet dö. Emellertidfalska positiva är ett betydande problem i den här skärmen. Uttryck av TDP-43, FUS, och α-syn är mycket giftiga, vilket skapar en stark selektivt tryck för uppkomsten av spontana genetiska suppressorer toxicitets orelaterade till Hsp104 varianten uttrycks. Därför har vi använt en sekundär skärm som också är relativt hög genomströmning för att eliminera dessa ospecifika toxicitetstryckare ^17. I denna sekundära skärm, väljs jäst behandlades med 5-Fluorootic Acid (5-FOA) för att motverka välja för Hsp104 plasmiden ^19. Stammarna bedöms sedan för substrat (TDP-43, FUS, eller α-syn) toxicitet via spotting-analys för att säkerställa att toxiciteten av substratet återställs efter förlust av Hsp104 plasmiden. Sålunda jäst i vilken toxicitet är återställd i denna sekundära skärm förmodligen ursprungligen toxicitet undertryckande på grund av närvaron av den Hsp104 varianten. Dessa jäst betecknas som "hits" och Hsp104 plasmiden bör då varautvanns och sekvenseras för att identifiera mutationer i Hsp104 genen ¹⁷ (Figur 1). Eventuella träffar bör därefter bekräftades genom att konstruera mutationen självständigt med användning av ställesriktad mutagenes och sedan testa om för toxicitet suppression. De potentiella tillämpningar för detta protokoll är breda. Med användning av dessa metoder, kan bibliotek av någon typ av protein screenas för varianter som hämmar toxicitet av någon substrat-protein som är toxiskt i jäst.

Protocol

1. Bibliotek Generation För att konstruera bibliotek av Hsp104 använder domänspecifika felbenägen PCR, först förstärka området av intresse med ett fel benägna DNA-polymeras 20. Rena PCR-produkten genom gel-extraktion. Utför en megaprimer förlängningssteg med en vanlig riktad mutagenes protokoll: kombinera 50 ng mall plasmid, 250 ng megaprimer, 200 ^ M dNTP, och high-fidelity DNA-polymeras i PCR-buffert, och späd till 50 ul total volym med PCR-kvalitet vatten 20…

Representative Results

Vi har konstruerat ett bibliotek av Hsp104 varianter randomiserade mitt domän och screenas det för undertryckande av TDP-43 toxicitet. Biblioteket transformerades och utströks på glukos och galaktos-plattor (figur 2) för att bedöma den stringens av skärmen. Enstaka kolonier valdes ut och stammarna räknaren valts med 5-FOA att eliminera Hsp104 plasmiden. Dessa stammar bedömdes sedan för att bekräfta att toxiciteten berodde på TDP-43 ensamt, utan Hsp104 varianterna. Spotting analyser av en del…

Discussion

Här presenterar vi vårt sätt att isolera potentieras Hsp104 varianter som hämmar toxiciteten av sjukdomsassocierade substrat med hjälp av jäst proteinopathy modeller. Med hjälp av denna metod kan stora bibliotek av varianter screenas med hög genomströmning, med den enda begränsningen är antalet varianter som passerar 5-FOA sekundär skärm. Genom att utföra dessa steg i 96 bra format, vi rutinmässigt screena upp till 200 träffar i taget i 5-FOA steg under loppet av 1-2 veckor. Antalet träffar som erhålli…

Materials

Table of Specific Materials/Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
150mm Petri dishes	Falcon	351058
5-Fluorootic Acid	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2mL Plates	Eppendorf	0030 502.302
96 bold replicator tool	V&P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200