In vivo e in vitro criação de Nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae e Heterorhabditidae)
Summary
O objetivo desta apresentação é demonstrar in vivo e in vitro técnicas para a criação de nematóides entomopatogênicos. Métodos in vivo consideram a criação destes nematóides com um inseto hospedeiro, enquanto que os métodos in vitro utilizam rico ágar.
Abstract
Nematóides entomopatogênicos (EPN) (Steinernematidae e Heterorhabditidae) têm uma parceria de mutualismo com Gram-negativo proteobactérias gama da família Enterobacteriaceae bactérias. Xenorhabdus estão associados com steinernematids nematóides enquanto Photorhabdus são simbiontes de heterorhabditids. Juntos nemátodos e bactérias formam um complexo insecticida potente que mata uma ampla gama de espécies de insectos numa íntima e específica. Aqui, demonstramos in vivo e in vitro de técnicas vulgarmente utilizadas na criação desses nemátodos em condições de laboratório. Além disso, estas técnicas representam passos fundamentais para o sucesso da criação culturas EPN e também servir de base para outros bioensaios que utilizam esses organismos de investigação. A produção de aposymbiotic nematóides (free-simbiontes) muitas vezes é fundamental para uma profunda e abordagem multifacetada para o estudo da simbiose. Esteprotocolo não requer a adição de antibióticos e pode ser realizada num curto período de tempo com equipamento de laboratório standard. Nemátodos produzidos deste modo são relativamente robusta, embora a sua sobrevivência na armazenagem pode variar dependendo da espécie utilizada. As técnicas detalhadas nesta apresentação correspondem aos descritos por vários autores e refinado pelo Laboratório de P. da Universidade do Arizona (Tucson, AZ, EUA). Estas técnicas são distintas do corpo de técnicas que são utilizadas na produção em massa destes organismos para fins de gestão de pragas.
Introduction
Nematóides entomopatogênicos (EPN) Steinernema e Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) e suas bactérias simbiontes, Xenorhabdus e Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) são considerados um modelo emergente de animal terrestre-micróbio relações simbióticas 2-4,6,10,19. Xenorhabdus e Photorhabdus spp. são abrigados como simbiontes no intestino da única etapa de vida livre dos nematóides, também conhecido como o juvenil infecciosa (IJ) ou 3a etapa infecciosa juvenil 8,10,13. O par bactéria nematóide é patogênico para uma ampla gama de insetos e tem sido implementado com sucesso no controle biológico e manejo integrado de pragas em todo o mundo 6,8.
Aqui vamos mostrar uma seleção de in vivo e in vitro técnicas que são frequentemente exercidos com a criação de EPN em condições de laboratório. Eun métodos in vivo contemplar um inseto hospedeiro para a criação dos nematóides. Normalmente, estágios imaturos de várias ordens de insetos (ou seja, Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, etc.) São considerados hospedeiros apropriados. Métodos in vivo são geralmente considerados para a manutenção de culturas de nematóides no laboratório. Este método pode não ser apropriado quando se considera a produção em massa dos nematóides. Grandes quantidades de insetos hospedeiros podem ser necessários para este fim exigindo mais tempo e os custos adicionais relacionados com o inseto criação.
Nematóides podem também ser cultivadas in vitro em vários meios de comunicação. Dependendo do objetivo do estudo, métodos in vitro podem ou considerar a incorporação das bactérias simbióticas na mídia. Nesta apresentação, descrevemos dois métodos comumente utilizados para a propagação de EPN. Os componentes dos meios fornecer uma fonte de nutrientes para a bactéria simbiótica umnd uma fonte de esteróis para os nematóides. métodos in vitro oferecem a vantagem da criação de EPN sem um inseto hospedeiro.
Originalmente, muitos dos meios de comunicação in vitro desenvolvido foram utilizados para a multiplicação de EPN quando insetos hospedeiros adequados não estão disponíveis. No entanto, ao longo dos últimos anos, in vitro métodos de criação tornaram-se amplamente utilizados em pesquisas com o objetivo de entender a relação de mutualismo entre EPN e suas bactérias simbióticas 17,19.
As técnicas detalhadas nesta apresentação correspondem aos descritos por vários autores e refinados pelo Banco Laboratory, da Universidade do Arizona (Tucson, AZ, EUA). Estas técnicas são distintas do corpo de técnicas que são utilizadas na produção em massa destes organismos para fins de gestão de pragas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando um hospedeiro adequado é um fator chave para o sucesso na criação vivo da EPN. Normalmente, ambos os steinernematids e heterorhabditids podem se reproduzir e concluir com êxito o ciclo de vida das larvas da traça da cera, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). No entanto, outras espécies de insetos de diferentes famílias e / ou encomendas podem ser considerados. Algumas das espécies nematóides actualmente descritos são conhecidos por ter especificidade para um hospedeir…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer aos membros anteriores do Banco de laboratório: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson e Sam-Kyu Kim por suas contribuições para a melhoria de muitos destes protocolos. Este trabalho foi financiado em parte pela concessão da National Science Foundation IOS-0840932 e 0724978 para IOS-SP da
Materials
| Material | Company | Catalog Number | Comments |
| For in vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter Paper, 9 cm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-Kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef Liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef Kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium Chloride 2.5g ( 0.5% final concentration ) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H20 | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient Broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast Extract, 5g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate, 10 ml (0.2g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn Oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn Syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H20 and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H20,890 ml |
References
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